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单克隆抗体具有良好的特异性和更高的亲和力,能够进行可重复性的大量生产,在疾病的诊断和治疗、科学研究等领域被广泛应用。然而,其作为异源物质,进入人体后将激起机体的HAMA(humananti-mouseantibody)反应(人抗鼠抗体反应)。为了解决这一问题,目前较为普遍应用的方法是鼠源单克隆抗体的“人源化”。
本文建立了一套具有特色的体内分子定向进化策略,用于抗体改型。该策略与以结构为基础的抗体改型策略不同,不需要反复繁琐的计算机运算,设计操作相对简捷。首先选择与鼠源轻、重链V区同源性最高的人抗体轻、重链V区序列作为骨架序列,将鼠源抗体的CDR区序列置换骨架序列的CDR区,然后分别列出轻、重链V区如下五种序列进行比对:置换了CDR区的骨架序列、鼠源抗体序列、该鼠源抗体的种系序列、未置换CDR区的人抗体骨架序列、该骨架序列的种系序列。根据FR区氨基酸残基在进化过程中的保守程度,对置换了CDR区的骨架序列FR区中个别的氨基酸残基进行取舍、简并,设计改型单链抗体库。用重叠PCR构建所设计的基因,接着用易错PCR引入随机突变,构建了库容为1.15×106的次级改型单链抗体库。再采用噬菌体展示技术筛选出了一个具有高亲和力的克隆,连入表达载体进行筛选产物的表达,最后用ELISA和竞争FACS检测表达产物的亲和力和特异性。ELISA结果显示,改型抗体Kd=1.51×10-6M,与亲本鼠源抗体Kd=1.84×10-6M相比没有明显降低。应用这种方法,我们成功地进行了鼠源抗CEA单链抗体的改型,获得了具有较高亲和力和特异性的改型抗CEA单链抗体。