论文部分内容阅读
目的构建人白细胞介素-24(human interleukin-24, hIL-24)真核表达载体,将其与人核心蛋白聚糖(human decorin, hDCN)重组质粒转染到HepG2细胞中,观察外源性基因hIL-24和DCN单独及联合对HepG2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法1.采用RT-PCR从人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24 cDNA编码序列,应用DNA重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并进行PCR、酶切及测序鉴定。2.采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)-IL-24和pcDNA3.1(+)-DCN转染至HepG2细胞,RT-PCR检测转染细胞中IL-24和DCN mRNA的表达情况。3.转染后48h倒置显微镜下观察HepG2细胞生长状况、形态改变及凋亡小体形成情况。4.分别在转染后24h、48h和72h,采用MTT法观察IL-24和DCN单独及联合转染对HepG2细胞的抑制效应。5.转染后48h流式细胞仪检测HepG2细胞凋亡情况,并进行细胞周期阻滞分析。结果1.通过RT-PCR克隆得到hIL-24基因cDNA编码序列。重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、酶切及测序证实构建成功。2. RT-PCR方法在转染HepG2细胞检测到IL-24和DCN mRNA的表达。3.转染后48h倒置显微镜下可见典型的凋亡细胞形态改变：细胞密度变小,折光性减弱、细胞皱缩变圆,细胞膜出泡呈现沸腾现象,部分细胞小泡脱落形成凋亡小体。4.MTT结果显示,转染后48h,单独转染IL-24和DCN基因对HepG2细胞抑制率分别是14.64±2.36(%)和17.97±5.17(%),明显高于空质粒对照组6.29±2.90(%)(p<0.01),双基因联合转染组的抑制率是31.88±6.57(%),与对照组和单独转染组都有统计学差异(P＜0.01)。转染后72h,IL-24组和DCN组细胞抑制率分别是18.51±3.40(%)和20.77±2.39(%),与空白对照组有明显差异,而联合转染组抑制率36.83±3.76(%),与单独转染组也有显著性差异(p<0.01)5.流式细胞仪检测发现,单独转染IL-24和DCN基因可诱导HepG2细胞出现不同程度凋亡,早期凋亡率分别为20.01±1.08(%)和22.20±0.91(%),而双基因联合转染组细胞凋亡率可达32.56±0.90(%),与空白组和单独转染组都有显著性差异(P<0.01)。6.细胞周期分析结果表明,与两个对照组相比,IL-24基因转染组的G2/M期细胞比例(11.24±0.35%)和DCN基因转染组的G0/G1期细胞比例(77.93±0.67%)明显增高(P<0.01),而双基因联合转染组则G0/G1期和G2/M期细胞比例同时增高,分别是71.36±0.60(%)和10.39±0.67(%),差异有统计学意义(P<0.01)结论1.成功构建了hIL-24基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24。2.应用脂质体成功将外源性基因hIL-24和hDCN转染入肝细胞癌细胞株HepG2细胞。3.外源性基因IL-24和DCN的单独转染对HepG2细胞有增殖抑制和凋亡诱导作用,联合转染上述基因可以协同发挥较单独应用更强的抑制HepG2细胞生长和诱导其凋亡的作用。4.IL-24可使HepG2细胞发生G2/M期阻滞,DCN可使HepG2细胞发生G0/G1期阻滞,双基因联合转染组HepG2细胞同时发生G2/M和G0/G1阻滞,细胞生长在上述两个节点同时受阻。