论文部分内容阅读
本文以丹参（Salvia miltiorrhiza Bung）叶片诱导的悬浮培养细胞为材料，探讨了以水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）为诱导子对丹参悬浮培养细胞的生长、迷迭香酸的合成积累以及对与迷迭香酸生物合成代谢过程密切相关两种酶（苯丙氨酸解氨酶PAL和酪氨酸氨基转移酶TAT）活性影响的研究；同时考察以水杨酸为诱导子，在诱导丹参培养细胞合成迷迭香酸的生物过程中所产生的信号分子（茉莉酸甲酯和过氧化氢）及其在水杨酸诱导迷迭香酸合成中的作用，为揭示诱导子诱导丹参培养细胞产生次生代谢物的诱导机制及其信号转导途径提供理论基础，进而为以后利用细胞培养法生产次生代谢物并更好地调控次生代谢物的产量提供技术参数。取得了以下主要结论：1. SA和MeJA诱导均可提高丹参培养细胞中迷迭香酸的合成积累量，且丹参培养细胞对这两种诱导子的诱导反应均呈最适浓度型。较低浓度的SA可以调控丹参培养细胞生成较高含量的迷迭香酸，浓度为0.04525mmol/L的SA诱导子诱导丹参培养细胞合成迷迭香酸合成量达峰值时，诱导组含量为对照组的1.36倍；10200μmol/L浓度范围的MeJA均可在不同程度上诱导丹参培养细胞中迷迭香酸含量的增加。诱导24h时，诱导组中的迷迭香酸合成积累量显著高于对照组水平；10μmol/L的MeJA诱导丹参培养细胞中积累的迷迭香酸含量达峰值时为对照组的2.74倍；诱导72h时，低浓度（10100μmol/L）的诱导效果显著高于高浓度（150200μmol/L）的诱导效果，主要是由于高浓度的MeJA对细胞造成了严重的毒害，引起细胞大面积死亡、培养基浑浊。2. SA和MeJA诱导子可以提高丹参培养细胞内迷迭香酸合成过程中相关酶PAL和TAT的活性。丹参培养细胞受到SA和/或MeJA的诱导作用后，在迷迭香酸的生物合成过程中，培养细胞内PAL的活性变化与迷迭香酸合成积累量之间表现出显著的正相关；而TAT的活性变化与迷迭香酸的合成积累量之间并未表现出显著的正相关性。由此推测，丹参培养细胞合成迷迭香酸时，PAL的酶促作用比TAT明显，且诱导子的诱导作用可能是通过活化细胞中PAL的活性而实现的。3. MeJA和H2O2均是SA诱导丹参培养细胞合成迷迭香酸生物过程中的信号分子，且MeJA位于H2O2的上游介导迷迭香酸的生物合成。SA诱导子诱发了MeJA和H2O2这两种胞内信号分子的生成，外源使用MeJA的清除剂（IBU）和H2O2的淬灭剂（CAT）处理丹参悬浮培养细胞后，IBU和CAT处理组中迷迭香酸的积累量均低于空白对照组，说明MeJA和H2O2均参与了迷迭香酸的生物合成；IBU处理抑制了丹参培养细胞中H2O2信号分子的形成，而CAT处理并未减少细胞中MeJA的含量，因此推测在SA诱导丹参培养细胞合成迷迭香酸的过程中，MeJA可能是位于H2O2上游的信号分子。