UHRF家族蛋白是以具有多个结构域为特点的一组蛋白,包含4个成员。其中,以UHRF1研究最多,UHRF1被报道在多个生物学过程中发挥重要作用,比如它能够维持DNMT1介导的DNA甲基化。UHRF2具有与UHRF1相似的序列和结构域。这种结构上的相似性预示着两个蛋白之间功能的保守性。如同UHRF1,UHRF2也能够识别半甲基化DNA以及甲基化的组蛋白,在体外也被证明与DNMTs以及组蛋白甲基转移酶G9a相互作用。然而,UHRF2与UHRF1也有着显著的不同。UHRF2不能够挽救Uhrf1缺失胚胎干细胞的DNA甲基化缺陷,因为UHRF2没有在细胞周期S期招募DNMT1至复制位点的能力。此外,由于UHRF2-SRA结构域对羟基化的结合偏好性,UHRF2被报道是羟甲基化DNA的特异性结合因子。如同UHRF1,UHRF2同样被报道与肿瘤相关。但是对于UHRF2在肿瘤中表现的相关报道都比较浅显且模糊。一些研究称UHRF2表现出肿瘤抑制因子的特性,因为它能够干扰细胞周期的进程。而也有报道显示,由于UHRF2的表达量在某些肿瘤中上调,UHRF2可能具有潜在的原癌基因特性。关于UHRF2与肿瘤相关性的报道目前来说十分有限,UHRF2在肿瘤发生过程中的精确生物学功能,以及它是否如同UHRF1一样可能参与转移相关的过程,还需要进一步的研究。转移是恶性肿瘤的重要特点,90%的癌症死亡都是由于转移导致。癌症细胞的转移是一个非常复杂的过程,这个过程中,细胞发生上皮-间质转化,从而获得侵袭和转移的能力。在上皮-间质转化的过程中,上皮细胞失去细胞-细胞间连接和细胞极性,获得间质样细胞的特性,同时转移和侵袭能力增强。上皮-间质转化是一个多级调控的过程,转录因子激活调节下游目标蛋白的表达变化,从而扰动细胞-细胞间连接、细胞极性、骨架结构以及胞外基质降解等多个生物学过程。虽然有关上皮-间质转化的研究近年有许多报道,但相关转录因子如何发挥调控机制依然需要进一步的探索。蛋白质组学技术是生物学研究中进行大规模蛋白质分析的强大手段。本实验室近年建立了一套快速非标定量的流程,能够在12小时的质谱时间里鉴定8000个蛋白质。这使得我们可以快速地进行大量样本的鉴定。同时,我们还发明了一种转录因子富集技术,能够有效富集内源性转录因子这种生物体中的低丰度蛋白,并进行定量。将蛋白表达水平的检测与转录因子-DNA结合活性的检测相结合,使得我们能够关联转录因子的活性及其目标蛋白的表达量变化。来自转录因子及蛋白表达水平的双重信息的综合分析,能够为蛋白可能发挥的生物学功能以及参与的信号转导通路,提供重要的生物学线索。使用多重组学方式探索蛋白功能及机制,将是具有重要意义的揭示蛋白秘密的手段。在本篇文章中,为了探索UHRF2的功能,我们使用了蛋白表达水平的质谱鉴定,转录因子活性变化的质谱鉴定,IP-质谱鉴定以及Ch IP-seq测序等多维度组学手段,检测UHRF2在癌症细胞系中过表达时引起的生物学变化。首先我们检测了UHRF2在胃癌细胞系MKN74中过表达诱导的蛋白水平变化。在肽段1%FDR水平,共有7662个特异蛋白被质谱检测。经过统计学分析,192个蛋白呈现上调变化,297个蛋白表现出下调变化。进行GO分析后发现,上调蛋白主要定位于细胞核、大分子复合物及胞质内,而下调的蛋白质则主要位于细胞-细胞间连接、基底膜以及内膜系统中。鉴定结果显示UHRF2抑制了许多上皮细胞表面标志物的表达,包括CDH1、JUP、TJP1、DSG2、INADL、SPINT2、CXADR、SPINT1以及TJP2;同时,稳定了一些包括p53在内的重要核蛋白的表达。UHRF2过表达诱导的差异蛋白分析表明,UHRF2与细胞粘附及肿瘤转移有重要相关性。为了进一步探索UHRF2过表达诱导蛋白水平变化的驱动因素,我们使用了TFRE富集加质谱检测的手段,检测转录因子-DNA结合活性的变化。这使得我们能够观测到一组全蛋白鉴定无法检测的低丰度转录因子。在肽段1%FDR水平,我们检测到581个转录因子以及537个转录共调控因子。经过统计学分析,其中17个转录因子及8个转录共调控因子因UHRF2过表达而出现DNA结合活性的增强。根据文献报道,其中5个活性增强的转录因子被注释为上皮-间质转化相关转录因子。这些分析表明转录因子-DNA结合活性的变化与蛋白表达水平的变化具有非常好的一致性,且都支持同一个模型:UHRF2过表达导致EMT转录因子的激活以及EMT相关蛋白的表达变化。结合组学鉴定提供的信息,为了进一步验证UHRF2参与EMT过程,我们使用CRISPR-Cas9技术在恶性胃癌细胞系SGC7901以及BGC823中使用不同的引导RNA(g RNA)敲除UHRF2并进行Transwell实验评估细胞转移能力。与对照组相比,UHRF2敲除非常明显地抑制了细胞迁移和侵袭能力。此外我们还发现,UHRF2的缺失诱导SGC7901细胞发生了明显的形态变化,由间质样细胞向上皮样细胞转变,同时细胞之间发生聚集。这些结果表明UHRF2对调控细胞转移能力具有重要作用。我们使用UHRF2抗体及对照Ig G抗体进行了Ch IP实验以寻找UHRF2与DNA结合的位点,结果表明,UHRF2与CDH1的启动子区域有结合,可能作为一个转录共调控因子与EMT-TFs一起调节CDH1的表达。为了进一步证实这个猜想,我们进行了IP-质谱鉴定实验,以探寻UHRF2相互作用蛋白。结果表明,UHRF2与一些表观调控复合体相结合,且与EMT转录因子TCF7L2有相互作用,进一步提供了UHRF2参与EMT过程的证据。综上所诉,在本篇文章中,我们证明了UHRF2作为一个转录共调控因子通过调节上皮-间质转化过程影响肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。我们在胃癌细胞系中过表达UHRF2蛋白,然后进行多维度的组学分析。全蛋白表达的鉴定结果提示UHRF2对细胞-细胞间连接具有抑制作用;转录因子-DNA结合活性的检测表明UHRF2过表达引起EMT转录因子活性的升高;生物学实验证明敲除UHRF2能够抑制肿瘤细胞的转移和侵袭能力;Ch IP-seq及相互作用蛋白组表明UHRF2作为一个转录共调控因子,与EMT转录因子一同参与EMT过程的调节。总之,我们的研究揭示了蛋白UHRF2的生物学功能,同时为蛋白功能研究提供了强大而有效的新手段,即通过多重组学鉴定,综合多个生物学层面的信息,获得蛋白功能及相关信号通路的全面线索,进而进行生物学功能的验证。