研究背景牙髓发育自外胚间叶,内含有神经、血管、牙髓干细胞、成牙本质细胞等成分,主要起到感觉、营养、形成牙本质、防御及修复的作用。由于牙髓外周无让性的坚硬牙本质的存在,复合根尖孔较小、无有效侧枝循环等因素的协同作用,牙髓一旦发生炎症、受其他刺激和损伤后均较难恢复。目前,根管治疗术是临床上针对不可逆性牙髓病变或根尖周病变最为常规的治疗方式,然而失去了牙髓的牙体硬组织有脆性增加、容易染色等问题,活髓切断术、根尖诱导成形术、牙髓血运重建等手段都无法完美解决该问题,寻找一种新的治疗方式刻不容缓。研究目的本课题旨在采用组织工程方法原位构建功能化牙髓,为临床上牙髓病变与根尖周病变提供新的治疗策略。研究方法与研究结果hDPSC可通过酶消化法从人牙髓中获得,该细胞具有较强的增殖能力,高表达间充质干细胞标志物CD105、CD73与CD90,几乎不表达内皮标志物CD144,因此,该细胞是一种扩增能力较强、干性程度较高的间充质干细胞。在体外培养时,hDPSC可以向成骨、成脂、成软骨、成神经、成血管方向分化。核磁共振谱显示我们成功合成了Gel MA,明胶上的部分氨基被MA取代后,仍然保留优良的生物相容性,同时机械性能提高,并具备光固化能力。冻干的Gel MA表现为典型的多孔支架结构。随后,我们采用基于DLP的3D打印技术进行逐层打印,构建了载hDPSC的Gel MA微球,直径为400μm,外形圆润饱满,包裹hDPSC,细胞在基础培养基中可增殖、铺展,即Gel MA水凝胶具有较好的生物相容性。此外,Gel MA可在机体内缓慢降解。通过对比Microsphere搭载的hDPSC、2D-Gel MA表面与2D-PS基板表面的hDPSC的生物学行为,包括细胞活性、铺展情况、增殖情况、干性维持能力与各向分化能力,我们了解到:hDPSC在三维与二维环境内都可以发生明显增殖,其中在2D硬质基板上增殖最为迅速。三维培养的hDPSC铺展速度较慢,体型较2D-PS组小,但具有更强的干性维持能力。此外,hDPSC在软基质表面的干性维持能力较硬质2D-PS基板表面的干性维持能力强。三维培养的hDPSC相比于二维培养的(Gel MA基底或PS基底)更具备向成神经、成血管方向分化的能力;在成牙本质向分化潜能方面,各组没有显著差异。此外,Gel MA降解未引起明显的炎症。随后,我们进行了原位或异位的动物实验,用于构建组织工程牙髓。首先,我们成功制备了暴露牙本质小管的部分脱矿牙本质片段,用作外周支架以构建牙髓牙本质复合体。将载hDPSC微球(Microsphere组)、hDPSC聚合体(Cell aggregation组)和hDPSC悬液(Cell division组)植入至根管4周或8周后,可形成粉红质软的组织工程牙髓。组织工程牙髓内的仍有大量细胞处于增殖阶段,Microsphere组和Cell aggregation组形成的组织工程牙髓内有微血管形成,且可检测到神经信号与成牙本质标志物的信号,其中Microsphere组的成神经及成牙本质能力相对更高,特异性标志物的表达水平与人正常牙髓较为一致,增殖、干性、炎症相关指标也有一定程度相似。大动物(小型猪)原位牙髓再生实验结果表明Microsphere、Cell aggregation均可在在根管中形成组织工程牙髓。根尖孔处均形成了致密组织团块,中部可见高度血管化的新生牙髓,并有少量均匀排列在周围的成牙本质样细胞形成;相比于Cell aggregation组,Microsphere组在牙髓腔上段形成的组织更接近正常牙髓结构,Cell division组未形成完整的组织工程牙髓,形成的组织主要在根管下1/3处,考虑为细胞悬液沉降后发生部分流失。我们进一步研究了载hDPSC Microsphere的神经向分化能力,通过脊髓损伤模型在组织学与功能学层面的修复情况证明该载细胞微球可修复神经,提示组织工程牙髓亦可能具备神经向分化的能力。结论本研究采用基于DLP的3D打印技术构建了载DPSC的Gel MA水凝胶微球,通过注射治疗获得再生牙髓。本文研究结论主要如下:1)hDPSC可通过酶消化法从人牙髓中获得,该细胞是一种扩增能力较强、干性程度较高的间充质干细胞。2)采用DLP打印技术构建的载hDPSC Gel MA微球可为细胞生长提供软质三维环境,有利于hDPSC维持干性并保留多方向分化的能力。3)位于微球上的hDPSC在体内具备维持干性与增殖的能力、形成血管与神经的能力及形成牙本质细胞的能力,可用于构建组织工程牙髓,有望在未来作为牙髓病变及根尖周病变的组织工程疗法应用于临床。