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枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）具有强大的蛋白质分泌能力,是十分重要的工业酶制剂生产菌种。大量来源于不同生物的外源基因已经在B.subtilis中实现了分泌表达,但分泌量低下这一瓶颈仍未得到解决。为了拓展B.subtilis在异源蛋白分泌生产中的应用,本论文从密码子优化、定点突变、启动子和信号肽优化以及Sec分泌途径瓶颈鉴定等几个方面入手以期提高异源蛋白分泌效率。两种α-淀粉酶AmyL和AmyS的编码基因amyl和amys分别来自Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus,其中amys是经过密码子优化并全基因合成而得。通过构建表达质粒pMA5L和p MA5S实现了两种基因在B.subtilis中的异源表达。以AmyL为例进行了定向进化研究,通过Leu134→Arg突变得到突变体AmyLM2,将AmyL最适反应p H由6.5降低为6.0,并在一定程度上提高了其热稳定性。启动子是影响基因转录的重要影响因子,选择比较了PHpaII、P43、PaprE和Pamyl等四个较强的启动子来控制amyl M2的转录,结果显示PaprE为最强的启动子。以一种半理性方法筛选比较了6种信号肽SPnprE、SPaprE、SPwapA、SPyncM、SPamyE和SPsacB,结果显示,与目的蛋白AmyLM2匹配最优的信号肽为SPnprE。将以AmyLM2为目的蛋白筛选所得最强启动子PaprE和最优信号肽SPnprE在AmyS上进行了验证。在B.subtilis中,Sec分泌途径是最主要的蛋白分泌途径。通过单独过表达23个Sec途经相关基因或基因操纵子,发现单独过表达prsA对α-淀粉酶分泌影响最大,AmyLM2和AmyS的α-淀粉酶活性分别提高了3.2倍和5.5倍。将PrsA在过表达水平和时间上进行优化,进一步提高了AmyLM2和AmyS的分泌量。此外,将prsA与9个筛选出的Sec途径相关基因或基因操纵子分别进行了组合过表达,发现prsA与dnaK operon组合过表达对α-淀粉酶分泌促进作用最大,分别将AmyLM2和AmyS的分泌量提高了160%和173%。综合以上结果表明分子伴侣PrsA和Dnak系列蛋白的不足是异源蛋白在B.subtilis中分泌表达的瓶颈之一。将出发菌株和工程菌株进行了详细的摇瓶发酵特性研究,工程菌株的AmyLM2和AmyS分泌量分别为出发菌株的9.1倍和11.7倍。最后,针对所得工程菌株1A237L和1A237S,在7.5L发酵罐（NBS,USA）中采用分批-补料的策略进行发酵,AmyLM2和AmyS的α-淀粉酶活性在84 h分别达到1352 U/m L和2300 U/mL。