论文部分内容阅读
神经管畸形(Neural Tube Defects,NTDs),是出生缺陷中发病率、死亡率最高的疾病,也是影响中国和世界人口素质的最常见和最严重的出生缺陷。其病因和发病机制至今仍不十分明确。研究发现妊娠早期补充叶酸可降低NTDs的发病率,但在排除了遗传因素并且叶酸充足的情况下,仍然可以出现NTDs的表型,与表观遗传学机制密切相关。组蛋白修饰是最常见的表观遗传学调控方式之一,具有调控染色质重塑及基因转录的重要作用。 组蛋白泛素化是调节基因转录不可或缺的环节,在神经系统发育中起关键作用。组蛋白泛素化是泛素分子以组蛋白为底物进行的泛素化修饰,目前研究最多的组蛋白单泛素化位点是组蛋白H2A第119位赖氨酸位点(H2AK119)和组蛋白H2B第120位赖氨酸位点(H2BK120)。不同于蛋白质的泛素化降解,组蛋白泛素化作为染色质状态的信号而非蛋白质降解的信号。CUL4B作为组蛋白泛素化连接酶与多梳抑制性复合体(Polycomb Repressive Complex,PRC2)相互作用调节组蛋白H2A第119位赖氨酸位点的泛素化(H2AK119ub)水平。CUL4B是E3连接酶复合体家族的骨架蛋白,定位于细胞核,参与核功能的调控。CUL4B参与多种生理病理过程,例如生长发育、肿瘤形成和X染色体连锁性精神疾病的过程。H2AK119ub的重要功能是维持同源盒基因(Homeobox Gene,Hox)的转录抑制状态,参与调控细胞增殖、干细胞多样性和细胞分化等多方面的生命活动。Hox基因在神经系统的早期发育中发挥重要作用,特别是在决定形态发生过程中的前-后(A-P)轴的确立方面起关键作用,是调控神经管闭合的关键基因。 维甲酸(Retinoic Acid,RA)作为外环境因素可以引起NTDs。RA可以通过调节H2AK119ub和H2BK120ub促进胚胎干细胞分化。RA与维甲酸受体结合后可以促进Hox基因的表达。那么RA是否与Hox基因的表达及NTDs的发生有关系?本课题发现组蛋白泛素化连接酶CUL4B与维甲酸相关孤儿核受体γ(Retinoic Acid-related Orphan Nuclear Receptorγ,RORγ)具有相互作用。在RA诱导下,组蛋白泛素化连接酶CUL4B是否通过与RORγ的相互作用协同影响组蛋白泛素化修饰进而影响NTDs的发生?组蛋白泛素化修饰是如何在RA的诱导下发生变化,如何影响Hox基因的表达,最终导致NTDs的发生?为了回答这些问题,确定了研究目的:研究RA调节组蛋白泛素化修饰引起Hox基因变化的分子机制和组蛋白泛素化修饰变化如何参与NTDs的发生。 本实验利用实时荧光定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹法、染色质免疫共沉淀结合实时荧光定量聚合酶链式反应、报告基因、免疫共沉淀、免疫组化、荧光条形码标记单分子检测技术证明了在细胞水平:RA诱导Hox基因表达上调,CUL4B和H2AK119ub表达水平降低,H2AK119ub和Hox基因结合降低。CUL4B和RORγ存在相互作用;CUL4B抑制ROR的转录活性。进一步研究发现CUL4B和RORγ共调控HOX基因的表达。在小鼠水平:RA诱导的NTDs小鼠胚胎脑组织,Hox基因表达上调,Cul4b基因下调,H2AK119ub表达水平下调。在临床样本水平:在人NTDs组织中,HOX基因表达上调好CUL4B基因下调伴随着H2AK119ub水平降低,CUL4B基因的表达与HOX基因的表达存在负相关性。 综上所述,NTDs的发生机制之一是RA通过影响具有相互作用的组蛋白泛素化酶CUL4B和维甲酸相关孤儿核受体ROR调控H2AK119的泛素化水平,从而影响Hox基因的表达,最终导致NTDs的发生。