二十二碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid,DHA）属于ω-3多不饱和脂肪酸家族,在细胞构成和信号传导方面有重要作用,具有保护神经系统、改善视力和显著抗肿瘤的活性。裂殖壶菌是一种高产油脂的微藻,是多不饱和脂肪酸的主要商业来源。裂殖壶菌中多不饱和脂肪酸的主要合成途径——FAS途径（Fatty acid synthase,FAS）和PKS途径（Polyketide synthase pathway,PKS）受到多基因的调控且作用机制未完全解析,尤其对β氧化途径在多不饱和脂肪酸合成代谢中的作用研究较少。本实验室在前期研究中确定了磷脂代谢途径甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（Glycerophosphocholine phosphodiestera,GDPD）,PKS 途径聚酮酰基还原酶（Ketoacylreductase,KAR）和β氧化途径烯酰辅酶A水合酶或异构酶（Enoyl-CoA hydratase/isomerase,IS）三个酶在裂殖壶菌多不饱和脂肪酸代谢途径中起到关键作用。本研究以SchizochytriumSR21为原始菌株,探究这三个关键基因对裂殖壶菌合成ω-3多不饱和脂肪酸的影响。同时,利用体外酶学试验,结合传统生物学光谱法和计算模拟方法探究蛋白酶与底物的相互作用机制。主要研究内容和结果如下:在Schizochytrium SR21中过表达Gdpd,72h生物量达34.91g/L,相对原始菌株提升3.22%。Kar过表达导致裂殖壶菌多不饱和脂肪酸占总油脂比例减少,但EPA比例达0.66%,相对原始菌株提升32%,该结果可能与β氧化途径加强,导致胞内氧化水平增加有关。Is过表达则导致裂殖壶菌生物量和总油脂产量同时降低。而Is敲除使得裂殖壶菌总油脂产量达23.63 g/L,相对原始菌株提升2.21%;多不饱和脂肪酸占总油脂比例达到40.75%,提升7.04%,EPA和DHA比例达到0.54%和33.27%,分别提升8%和11.87%。利用RT-qPCR对相关代谢途径基因表达情况进行监测,结果表明Is敲除菌株的FAS途径,β氧化途径,乙酰辅酶A合成途径和NADPH供应途径代谢减弱,而PKS途径加强,这导致总油脂产量和多不饱和脂肪酸比例增加。对IS蛋白进行功能探究。光谱学结果表明,IS分别催化两种短链脂肪酸β氧化中间体——反式-3-己烯酸辅酶A和反式-2-己烯酸辅酶A的异构和水合反应,验证了 IS具有异构酶和水合酶活性。分子对接模拟实验结果表明,IS催化异构反应时,主要通过催化活性区域附近Arg134与其底物以形成氢键的方式结合,而催化水合反应则是Lys60与其底物以形成氢键的方式结合。此外,反应底物链长越长,结合能力越强,表明IS对不同链长底物的选择特异性。IS作为β氧化途径中关键酶,参与多不饱和脂肪酸的氧化分解和转换,从而导致特定多不饱和脂肪酸的积累,阐明了 IS在裂殖壶菌的多不饱和脂肪酸代谢和转化方面的意义。