三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种大型海洋经济蟹类,具有重要的经济价值,在我国已开展了大规模的人工养殖,取得了良好的经济效益。盐度是三疣梭子蟹养殖中重要的环境因子,直接影响其生长、发育和存活。养殖过程中,盐度经常发生急剧变化(如暴雨或连续高温),给三疣梭子蟹养殖业带来巨大隐患。目前对于三疣梭子蟹盐度适应机制的研究开展较少,有关三疣梭子蟹的渗透调节类型、血淋巴渗透压主要调节离子和渗透调节主要供能物质等方面的研究至今尚未开展,三疣梭子蟹主要的离子转运酶基因功能研究较为匮乏,本研究系统进行了不同盐度下三疣梭子蟹血淋巴理化指标分析及V-ATPase和Na+/H+-exchanger基因功能研究,旨在为三疣梭子蟹盐度适应特性和渗透调节机制等方面的研究提供理论参考。具体研究内容分为以下四个部分:1.盐度胁迫对三疣梭子蟹血淋巴理化水平的影响为探索三疣梭子蟹在盐度适应过程中血清渗透压、离子浓度及血清生化指标的变化特点及规律,进而了解其渗透压调节机理及盐度适应过程中能量代谢机制,设置5、10、20和50共4个盐度实验组,以自然海水(盐度30)为对照组,进行了盐度胁迫实验。结果显示,0-12 h,低盐实验组血清渗透压较对照组表现为下降,50高盐实验组血清渗透压表现为上升;12-72 h,各实验组血清渗透压达到稳定状态。随着胁迫盐度的升高,血清与环境介质渗透压的差值先减小后稳定,未出现等渗现象。血清中Cl-、Na+、K+含量的变化与血清渗透压的变化相似,但血清与环境介质离子含量的差值表现为Cl-、Na+含量差值先下降后稳定,K+含量差值表现为先升上再下降最后稳定。实验组血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总蛋白(TP)含量总体表现为先降低后稳定,对照组血清GLU、TG和TP含量在0-72 h基本稳定,在整个盐度胁迫过程中,实验组血清GLU、TG和TP含量达到基本稳定后表现为与对照组盐度差值越大其含量降幅越大,同一实验组血清GLU和TP含量的最大降幅比TG含量的最大降幅大。各实验组血清GLU含量在0-9 h迅速降低,而血清TG和TP含量迅速降低发生在0-12 h。血清TP含量的最大降幅在盐度20实验组低于血清GLU含量最大降幅,在盐度5、10、50实验组内血清TP含量最大降幅高于血清GLU含量最大降幅。实验组血清尿素(UREA)含量总体表现为先升高后稳定并显著高于对照组(P>0.05),与血清GLU、TG和TP含量的变化趋势相反。盐度5和50实验组血清UREA含量相近,而血清TP含量则在盐度10与50实验组内相近。研究表明,三疣梭子蟹渗透压调节类型属于高渗调节型,Cl-离子和Na+离子在渗透压调节中起主要作用。血清GLU和TP是三疣梭子蟹渗透调节的主要供能物质且血清GLU首先代谢供能,不同盐度下三疣梭子蟹血清GLU与TP对渗透调节供能占比有所不同,高盐水环境中三疣梭子蟹血清自由氨基酸含量的部分增加可能来源于其它组织。2.三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鉴定及在盐度胁迫下的表达分析为查明Na+/H+-exchanger基因在三疣梭子蟹盐度胁迫过程中的功能作用,RACE技术克隆了该基因c DNA全长并进行生物信息分析,反转录实时定量PCR(RTq PCR)技术分析该基因组织表达分布及不同盐度胁迫过程中的表达变化。结果显示,Na+/H+-exchanger基因(Gen Bank:KU519329)全长4233 bp,5’和3’非编码区(UTR)长分别为519 bp和753 bp,开放阅读框(ORF)长2961 bp,编码986个氨基酸,预测蛋白质分子量为110.8k Da。生物信息分析显示,三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因与普通滨蟹(Carcinus maenas)同源性最高,达到87.2%,含信号肽和12个跨膜α螺旋。进化分析显示,三疣梭子蟹与普通滨蟹聚为一支;RT-q PCR分析显示,三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因呈鳃组织特异性高表达,基因在鳃组织中表达显示,对照组和盐度50实验组表达量基本稳定,盐度5、10和20实验组在0-12 h上调表达明显,24-168 h表达量整体呈下降趋势。研究表明,三疣梭子蟹属于“弱”高渗调节型蟹类,Na+/H+-exchanger基因主要在低盐环境下起渗透调控作用,高盐环境下作用不明显,对低盐环境下的渗透调节具有重要作用。3.三疣梭子蟹V-ATPase d亚基的克隆、盐度胁迫下表达分析及原核表达构建为查明V-ATPase d亚基基因在三疣梭子蟹盐度胁迫过程中的功能作用,通过RACE技术克隆了三疣梭子蟹V-ATPase d亚基基因c DNA全长并进行生物信息分析,对该基因进行了原核表达构建,采用RT-q PCR分析该基因的组织表达分布和不同盐度胁迫过程中的表达变化。结果显示,三疣梭子蟹V-ATPase d亚基基因(Gen Bank:KU519330)c DNA全长2307 bp,5’、3’UTR及ORF长度分别为:96 bp、1164 bp和1047 bp,编码348个氨基酸,预测蛋白分子量为39.7k Da。生物信息分析显示,V-ATPase d亚基基因编码氨基酸序列与无刺蜂同源性最高为83%,且序列呈高保守性,无信号肽。系统进化分析显示,三疣梭子蟹同无刺蜂等昆虫类亲缘关系最近。RT-q PCR分析显示,三疣梭子蟹V-ATPase d亚基基因在鳃中表达量最高,基因在鳃组织中表达显示,对照组在0-168 h表达基本稳定,盐度5、10和20实验组在0-12 h表达量增加,24-168 h表达量总体呈下降趋势。盐度50实验组表达量在0-9 h有少量增加,12-168 h整体呈现下降趋势。蛋白质谱分析显示表达肽段对理论肽段覆达到32%。研究表明,三疣梭子蟹V-ATPase d亚基基因主要进行低盐下渗透调控作用,高盐环境作用较弱,V-ATPase d亚基融合蛋白构建完成。4.三疣梭子蟹V-ATPase a亚基的克隆、表达分析及盐度胁迫对Na+/K+-ATPaseα亚基的表达和Na+/K+-ATPase与V-ATPase活性的影响为查明盐度胁迫对V-ATPase a亚基和Na+/K+-ATPaseα亚基基因表达和Na+/K+-ATPase与V-ATPase活性的影响,通过RACE技术克隆了三疣梭子蟹VATPase a亚基基因c DNA全长并进行生物信息分析,RT-q PCR分析V-ATPase a亚基和Na+/K+-ATPaseα亚基基因的组织表达分布及不同盐度胁迫过程中的表达变化,试剂盒测定Na+/K+-ATPase与V-ATPase活性。结果显示,三疣梭子蟹V-ATPase a亚基基因(Gen Bank:KU519328)c DNA全长3167 bp,5’、3’UTR及ORF长度分别为:174 bp、509 bp和2484 bp,编码827个氨基酸,预测蛋白分子量为95 k Da。生物信息分析显示,该基因编码氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高为77.6%,共6个跨膜结构域。系统进化分析显示,三疣梭子蟹同凡纳滨对虾聚为一支。RT-q PCR分析显示,三疣梭子蟹V-ATPase a亚基基因在鳃中表达量最高,基因在鳃组织中表达显示,0-168 h对照组表达量基本稳定,盐度5、10和20实验组0-12 h上调表达明显,24-168 h表达量下降后基本稳定。盐度50实验组0-12 h表达量增加,12 h后表达量呈下降趋势。三疣梭子蟹Na+/K+-ATPaseα亚基基因在鳃中表达量最高,对照组在0-168 h内表达量基本稳定,盐度5、10和20实验组中Na+/K+-ATPaseα亚基基因在0-12 h显示明显的上调表达,在24-168h表达量整体呈下调表达,盐度50实验组表达量在0-12 h快速增加,12 h后表达量整体呈下降趋势。酶活测定显示,Na+/K+-ATPase对照组和盐度50实验组以及V-ATPase对照组在0-168 h酶活基本稳定,盐度5、10和20实验组Na+/K+-ATPase和V-ATPase活力在0-168 h盐度胁迫过程中整体呈先增长后下降最后稳定趋势,盐度50实验组V-ATPase酶活在9-12 h酶活力呈现上调,12 h后下降并稳定。研究表明,Na+/K+-ATPase只在低盐下起渗透调控作用,高盐无作用,V-ATPase在低盐和高盐适应中均起渗透调节作用。