拟南芥SBPase分别催化底物SBP和FBP机理研究

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景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBPase)主要存在于叶绿体中,是高等植物光合作用中重要的调控酶。在光合作用暗反应阶段,SBPase催化景天庚酮糖-1,7-二磷酸(SBP)水解成一个磷酸分子和景天庚酮糖-7-磷酸。拟南芥因为其基因组小,生长周期短而成为植物科学研究中的模式生物。通过研究拟南芥SBPase(Ar-SBPase)结构、功能及催化机理,有助于我们进行以SBPase为靶标的除草剂的研发工作。本文主要开展了以下四个方面的研究工作:(1)Ar-SBPase的载体构建及表达纯化:构建重组质粒pCold Ⅱ-Ar-SBPase。实验证明以pColdⅡ为表达载体PGTF2为表达宿主细菌时,每升培养基可以获得2.4mg目标蛋白,比活力为5.34U/mg可溶性好、活性较高的Ar-SBPase。(2)Ar-SBPase既可以催化底物SBP,还可以催化FBP,经过测定,Ar-SBPase催化底物SBP的最佳反应温度为37℃,最适pH为8.8,最佳反应时间为6min,最适DTT浓度为1mM,与Mg2+的Ka值为2.238 mM,与底物的Km值为0.2607 mM,此时,最大的比活力为5.34U/mg;而Ar-SBPase催化底物FBP的最佳反应条件为在37℃下,最适pH为9.0,最适DTT浓度为15mM,与Mg2+的Ka值为2.415mM,与底物FBP的Km值为0.2217mM,此时比活力为2.12U/mg。比较以上数据,我们可以发现Ar-SBPase催化两种不同底物时,除了比活力相差近两倍以外,最大的区别是对还原剂DTT的敏感程度不同,Ar-SBPase催化SBP时,在低浓度DTT条件下,便有很好的催化能力,但是,对于催化FBP时,需要的DTT浓度与SBP的相比较要高出很多。(3)我们将Ar-SBPase与其他物种的SBPase酶动力学性质进行了比较,以弓形虫为模板进行同源模建,由于弓形虫蛋白结构中没有小分子空腔,所以我们以人的FBP活性空腔定义Ar-SBPase小分子空腔,通过分析活性空腔重要氨基酸残基位点,我们发现有十三个重要的氨基酸位点,分别是:R267,N265,N312,Y291,K321,R323,E327,D180,D177,D127,S182,R290,D298,在此之后我们将这些重要氨基酸全部定点突变成丙氨酸(A)并测其催化活性。实验结果表明:与野生型相比较,R267A,N265A,N312A,Y291A,E327A,D180A,D177A,D127A在突变之后催化活性变成了 0,而N312A,K321A,R323A催化活性降低了近90%,D298A活性降低了 20%,S182A的催化活性上升了 10%,从而模建结果与实验结果得到相互验证。(4)以Ar-SBPase为靶标,进行抑制剂活性测试,我们发现D13-tqd150,D13-tqd151,D13-tqd152这三个化合物具有较高的抑制活性,它们的IC50分别是7.27μM,7.05μM和8.99μM。这三个分子具有相同的骨架,后续工作可以以这三个分子作为骨架分子,对其结构进行优化改造,筛选更优的抑制剂。
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