研究背景:随着社会进步,经济发展和人们生活水平改善,饮酒变得越发普遍。酒精是一种中枢神经抑制剂,长期或一次过量酒精摄入均可以引起酒精中毒,损害多系统器官,例如消化和心血管系统,以及神经系统等,甚至可引起癌症发生[1-4]。在发育过程中,中枢神经系统(Central nervous system,CNS)对酒精刺激非常敏感[5,6]。孕期高剂量酒精暴露后,胎儿可以表现为出生后生长发育迟缓、面容异常、CNS功能障碍等[7-9],即胎儿酒精综合征(Fetal alcohol syndrome,FAS)。有研究表明,新生期小鼠在单次酒精注射后可引起新生期小鼠大脑海马区域神经干细胞损伤,小脑蒲肯野细胞和伯格曼胶质细胞损伤,以及神经细胞丢失[10,11];酒精对青春期边缘系统尤其对青春期海马更容易产生损伤作用,导致记忆受损[12-14]。磁共振成像研究显示酗酒和酒精依赖的青少年海马体积减小,同时相关功能研究显示海马的学习和记忆受到损害[15-19]。海马持续进行神经发生,并参与海马学习记忆等认知功能。有研究也显示,青春期大鼠酒精暴露容易造成海马结构损伤和行为学功能异常[20],甚至可影响神经发生[21]。放射状胶质细胞(Radial glial cells,RGCs)是组织形态、生化特性和功能方面独特的一类细胞,也是胚胎期间最早出现的具有干细胞功能的胶质细胞。其胞体位于脑室区(Ventricular zone,VZ),即早期神经管内壁的神经上皮层,细胞一端伸出一短的顶突附着于室管膜表面,另一端伸出细长且有短侧突的基底突起,并分出许多分支并终止于软脑膜侧。RGCs在CNS的发育过程中扮演着非常重要的角色,被认为是神经干细胞[22],它的发育与分化受到许多因素诱导调控[23]。另外,RGCs作为干细胞也存在于成年CNS内两个增殖区域:侧脑室壁的脑室下区(Subventricular zone,SVZ)和海马齿状回(Dentate gyrus,DG)的颗粒下区(Subgranular zone,SGZ)[24]。RGCs作为一种神经祖细胞,在板层结构(皮层、海马和小脑)发育过程中,可作为神经前体细胞产生胶质细胞和神经元,其胶质长纤维还可以充当“脚手架”作用引导神经元进行放射状迁移[23,25,26]。RGCs在海马齿状回(DG)可分为初级RGCs和次级RGCs。其中,初级RGCs与大脑皮质内的RGCs具有相似的结构形态,大部分位于海马DG区域(出生前),分布范围:从海马伞部至DG的软脑膜表面。RGCs放射状胶质纤维可引导新生神经元或前体细胞从神经上皮向齿状回原基进行迁移。而次级RGCs来自于海马DG区域(出生后早期)的非放射状前体细胞,维持生后海马DG的形态发生。次级RGCs充分发挥它的放射状胶质纤维“支架”作用,引导颗粒神经元迁移,并部分分化为星形胶质细胞。只有少数次级RGCs保留至成年而且作为神经干细胞参与到成年DG的神经发生中[23][15]。伯格曼胶质细胞(Bergman glial cell,BG)作为小脑内的RGCs,其结构形态与海马及皮层内的RGCs相似,放射状长纤维向软脑膜表面延伸[11,26]。在小脑皮质发生过程中,BG为不同类型的细胞提供“脚手架”迁移,促进小脑叶状结构和分层模式的正常发育,并且可以调节轴突和树突的生长方向[26]。近年来研究显示BG影响蒲肯野细胞的树突发育,BG的纤维引导蒲肯野细胞的树突生长,影响树突棘的形成;而随着发育的进程,伯BG的纤维能够促进蒲肯野细胞的突触形成,确保信号之间的正常传导[27]。也有报道指出,保持BG的长纤维“支架”可以维持蒲肯野细胞的存活[28]。为探究如何改善酒精暴露导致的脑发育损伤,我们用催产素(Oxytocin,OT)和白藜芦醇(Resveratrol,RSV)进行干预,分别观察OT和RSV对酒精暴露后青春期小鼠大脑和新生期小鼠小脑发育的影响,以期这些干预能改善酒精暴露后的脑发育损伤,并为临床上提供一种新的治疗手段。OT是一种神经肽(由9个氨基酸构成),大部分由下丘脑视上核和室旁核合成。它的分泌受下丘脑—垂体—性腺轴的调控,在青春期,下丘脑—垂体—性器官的发育趋于成熟,催产素分泌达到新的水平。最初临床应用催产素来加强子宫收缩来治疗滞产,又称“缩宫素”;随着研究的深入,人们发现催产素的功能和作用十分广泛,近年来有研究报道催产素可以促进细胞增殖以及海马神经发生[29],而且在哺乳动物的母性行为、配偶结合、社会认同、压力和焦虑等社交行为中也发挥重要的作用[30,31]。目前有关催产素对酒精暴露后青春期小鼠大脑发育的作用研究不多。因此,在青春期小鼠酒精暴露后,我们用OT进行干预,以期可以改善酒精暴露导致的大脑发育损伤。关于RSV,主要存在于红葡萄皮和某些药用植物中的一种天然的对二苯代乙烯类物质[32,33]。我们实验室前期研究显示,酒精暴露后RSV可以保护新生期小鼠大脑海马齿状回的RGCs,促进其神经发生,减轻酒精暴露导致的新生期小鼠大脑发育损伤,而有关RSV是否能够改善酒精暴露后新生期小鼠小脑发育损伤的研究不多,相关作用途径及机制尚不明确。因此,基于我们的前期研究,在本课题中,新生期小鼠酒精暴露后,我们采用RSV进行处理,以期可以改善酒精暴露后引起的新生期小鼠小脑发育损伤。研究方法与研究结果:第一部分OT对酒精暴露后青春期小鼠大脑发育的作用1.应用免疫组织化学方法,采用溴脱氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyuridine,BrdU)对大脑海马齿状回SGZ区域的增殖细胞进行标记,显示OT使酒精暴露后青春期小鼠大脑海马齿状回SGZ区域增殖细胞数量增加。2.应用免疫组织化学方法,采用小清蛋白(Parvalbumin,PV)标记大脑海马齿状回SGZ区域的PV阳性中间抑制性神经元,显示OT使酒精暴露后青春期小鼠大脑海马齿状回SGZ区域PV阳性中间神经元数量增加。3.应用免疫组织化学方法,采用性别决定相关HMG盒2(Sry-related HMG box2,Sox2)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)荧光共标对大脑海马齿状回SGZ区域的RGCs进行标记,显示OT可能会使酒精暴露后青春期小鼠大脑海马齿状回RGCs数量增加。第二部分RSV对酒精暴露后新生期小鼠小脑发育的作用1.应用免疫组织化学方法,采用钙结合蛋白D-28K(Calbindin D-28k,CBD-28K或CB)标记小脑的蒲肯野细胞,显示RSV使酒精暴露后新生期小鼠小脑CBD-28K标记蒲肯野细胞数量增加。2.应用免疫组织化学方法,分别采用脑脂质结合蛋白(Brain lipid-binding protein,BLBP)和GFAP标记小脑的伯格曼胶质细胞,显示RSV使酒精暴露后新生期小鼠小脑伯格曼胶质细胞数量增加。3.应用免疫组织化学方法,采用小胶质细胞标志物Iba1(Ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)标记小脑的小胶质细胞和蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测小脑内核因子-κ结合基因(Nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)表达水平,显示RSV使酒精暴露后新生期小鼠小脑内小胶质细胞数量减少和NF-κB表达水平下降。研究结论研究结果提示:OT和RSV可以通过对脑RGCs的保护,降低酒精暴露后脑发育中细胞损伤和丢失,改善酒精暴露后的脑发育。