【摘 要】
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目的:对野生的人内皮抑素(endostatin,简称ES)基因进行结构改造,研究改造前后的内皮抑素蛋白的活性变化;同时摸索重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,简称rhES)的
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目的:对野生的人内皮抑素(endostatin,简称ES)基因进行结构改造,研究改造前后的内皮抑素蛋白的活性变化;同时摸索重组人内皮抑素(recombinant human endostatin,简称rhES)的最佳生产工艺路线,解决rhES在大肠杆菌中提取时产生的蛋白沉淀问题.方法:(1)运用定点诱变的方法,在人内皮抑素基因中产生编码RGDRGD(Arg-Gly-Asp-Arg-Gly-Asp)的碱基序列.(2)按所优化的条件进行rh ES的表达,包涵体的提取,洗涤,变性,复性.(3)活性检测:①动物实验:观察结构改造前后的内皮抑素对裸鼠皮下移植瘤的生长情况及病理组织学与免疫组化指标的影响.②细胞实验:MTT法及细胞迁移抑制试验观察改造前后的内皮抑素对肺癌AGZY细胞系的作用.结果:(1)成功的在野生人内皮抑素基因内诱变产生编码RGDRGD的碱基序列.(2)每升培养基可得可溶性rhES蛋白10.55mg,rhES在大肠杆菌中的表达量超过总菌体蛋白的60﹪,纯化后的蛋白纯度超过95﹪.(3)动物实验:野生与诱变内皮抑素的抑瘤率分别为40.66﹪和51.05﹪.在4个肿瘤指标中均可以看出诱变组抑瘤作用的趋势比野生组强.病理学苏-伊染色及半薄切片可以看出诱变组肿瘤的血管生成比野生组减少.免疫组化结果:诱变组在MVD(P<0.05)、VEGF(P<0.05)、PCNA(P>0.05)三个指标上均比野生组减小.(4)细胞实验:MTT结果表明,野生组内皮抑素半数抑制浓度IC<,50>=185ug/ml,诱变组内皮抑素IC<,50>=27 ug/ml.细胞迁移试验表明野生组与诱变组内皮抑素均对肿瘤细胞有抑制作用,野生组迁移抑制率为68.95﹪;诱变组迁移抑制率为89.94﹪.结论:(1)产生了RGDRGD序列的诱变型内皮抑素比野生型内皮抑素拥有更高的抗肿瘤活性.(2)该实验所优化的生产工艺路线可获得可溶性、高纯度、高活性的rh ES蛋白,解决了rh ES在大肠杆菌中提取时产生的蛋白沉淀问题.
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