本文主要从以下几方面进行论述：　　第一部分 人胚胎干细胞及衍生心血管前体细胞的钙信号特征和分子基础　　目的:　　钙离子(Ca2+)是细胞内的第二信使。虽然对成体来源的多种细胞类型，如神经细胞、心肌细胞中钙信号的特征已有较为清晰的了解，但受限于技术条件或细胞来源，对于发育早期某些特定类型的细胞，如人胚胎干细胞(humanembryonic stem cells，hESCs)及其衍生的组织前体细胞中钙信号特征和调控机制还知之甚少。hESCs衍生的组织前体细胞，如心血管前体细胞(cardiovascularprogenitor cells，CVPCs)是研究组织前体细胞中钙信号调控的理想细胞来源，明确hESCs及CVPCs中钙信号调控对理解多能干细胞维持自我更新的机制及分化命运决定有重要意义。　　方法:　　首先，通过比较不同细胞样本制备方法，建立基于激光共聚焦显微镜的钙信号记录分析系统;其次，通过钙成像系统记录hESCs和CVPCs在静息状态下的自发钙信号特征;用RT-PCR和qPCR检测这两类细胞中钙离子相关通道和泵的基因表达谱;利用靶向三磷酸肌醇受体(inositol1，4，5-trisphosphate receptors，IP3Rs)、内质网钙泵(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-ATPase，SERCA)、细胞质膜钙泵(plasma membrane calcium-ATPase，PMCA)及钠/钙离子交换体(sodium calcium exchanger，NCX)的抑制剂，研究hESCs和CVPCs中参与维持胞质钙稳态的钙离子通道和钙泵;在培养过程中加入ATP，用(propidium iodide)PI染色检测hESCs细胞周期的变化，利用(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)检测细胞存活力的变化;利用细胞周期同步化工具药nocodazole将hESCs的细胞周期同步后，观察ATP对细胞周期的作用;用(1，2-bis(o-aminophenoxy) ethane-N，N,N,N-tetraacetic acid，BAPTA）螯合胞内Ca2+后孵育ATP，观察处理对细胞周期的变化;最后，在hESCs和CVPCs培养或分化过程中加入不同剂量IP3Rs抑制剂(2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)，流式细胞仪分析CVPCs标记物表达，检测细胞的存活力。　　结果:　　1.团块贴壁法和单细胞贴壁法制备的hESCs样本对Ca2+指示剂的孵育效果有较大区别，团块贴壁法获得的克隆较大，对于钙离子指示剂的标记不均一;相反单细胞贴壁法获得的克隆较小、大小均一，Ca2+指示剂的标记均匀，获得的数据可反应大部分细胞特征，适合用于钙成像研究;　　2.钙成像显示hESCs无自发钙活动，而CVPCs具有活跃的自发钙活动，且钙活动有两种不同的形式，即细胞内的局部钙活动和多细胞间的钙传递;　　3.在钠钙交换体中，hESCs表达NCX1，NCX2和NCX3，而CVPCs仅表达NCX1;在细胞膜的钙离子泵中hESCs表达PMCA1，PMCA3和PMCA4，而CVPCs仅表达PMCA3;在钙库依赖性钙通道中，hESCs和CVPCs均表达ORAI1，ORAI2和ORAI3，以及TRPC3，TRPC4e，TRPC6和TRPC7;在内质网钙泵中hESCs和CVPCs均表达SERCA1，SERCA2和SERCA3;　　4.阻断NCX，PMCA，SERCA均促使hESCs胞内钙浓度上升;排空胞内钙库后，胞外孵育高钙溶液可使胞内钙浓度迅速升高，说明上述钙离子通道和泵，以及钙库依赖性钙内流(store operated calcium entry，SOCE)参与hESCs钙稳态调控。　　5.孵育24小时ATP（100μM）使hESCs细胞周期的G2/M期比例升高，但持续孵育ATP5天却抑制细胞增殖;同步hESCs细胞周期至G2/M期，再孵育ATP，其作用消失;BAPTA可阻断hESCs中ATP刺激触发的钙活动，同时孵育BAPTA和ATP进一步促进G2/M期比例升高，表明Cd+信号负调控这一过程;　　6.hESCs向CVPCs分化过程中用抑制剂2APB阻断IP3Rs钙释放不影响hESCs向CVPC的分化，但抑制分化过程中细胞的存活。　　结论:　　1.单细胞贴壁法适合用于hESCs的钙成像样本制备;　　2.hESCs无自发钙活动而CVPCs具有活跃自发钙活动;　　3.hESCs和CVPCs的Ca2+转运相关基因表达具有相同点，但在亚型的选择上存在差异;　　4.hESCs维持钙稳态的分子基础为:降钙方式—内质网SECRA的回泵和质膜PMCA与NCX的外排;升钙方式—IP3Rs介导的Ca+释放和SOCE;　　5.钙信号负调控ATP对细胞周期的阻滞作用;　　6.hESCs向CVPCs分化过程中IP3Rs介导的胞内钙库的释放促进分化过程中细胞的存活。　　第二部分 嘌呤能P2受体(P2Rs)和三磷酸肌醇受体(IP3Rs)对hESCs及衍生CVPCs中a钙信号的调控及机制　　目的:　　嘌呤能信号（purinergic signaling，PS）广泛存在于机体组织中的信号通路，其受体分为P1受体(P1R)和P2受体(P2R)两大类，P1R的天然配体是腺苷(adenosine)，P1R活化可激活或抑制环化单磷酸腺苷酸(cAMP); P2R的天然配体是除腺苷之外的各种核苷酸，如ATP，UTP，ADP，UDP等，其下游包括Ca2+及cAMP。嘌呤能信号在机体的各项生理和病理过程中起到重要作用，然而在hESCs及衍生CVPCs中，其功能和调控机制的研究几乎空白，阐明其在这一分化体系中的作用，将为揭示多能干细胞及组织前体细胞的钙信号调控和胚层分化命运决定提供新的视角和依据。　　方法:　　首先，利用不同核苷酸瞬时刺激hESCs和CVPCs，实时记录细胞内Ca2+浓度变化。分析发生钙瞬变细胞的比例和钙瞬变的振幅，绘制浓度-反应曲线(CRC)和浓度-振幅曲线(CAC)，进行回归分析，计算每种核苷酸的半数激活浓度(EC50)，回归曲线的希尔斜率（slope）以及截距(intercept)，比较hESCs和CVPCs对不同核苷酸刺激的敏感性，初步确定其作用的P2R亚型。之后用RT-PCR和qPCR检测hESCs和CVPCs中P2Rs和IP3Rs基因表达谱，结合P2Rs特异性激动剂和抑制剂，明确两种细胞中功能性P2Rs亚型。利用shRNA介导的基因敲低(KD)和TALEN介导的基因敲除(KO)手段，建立IP3R3KD和IP3R2KO的hESCs，检测IP3R基因操作后上述细胞对核苷酸反应性的影响。　　结果:　　(1)hESCs和CVPCs对ATP、UTP均呈现浓度依赖性钙反应，CPVC对ATP和UTP的敏感性和钙反应强度要大于hESCs;　　(2)PCR结果显示大部分P2Y在CVPCs均有表达，而hESCs中只有部分亚型表达，且其表达量远低于CVPCs;　　(3)在无钙环境下，ATP仍能引起hESCs和CVPCs中的钙活动，且反应比例并没有降低;P2R非特异性抑制剂只能消除ATP在hESCs中的作用，而CVPCs中仍有一定反应比例;2APB可以完全消除ATP在hESCs和CVPCs中的钙反应;　　(4)P2Y1特异性抑制剂MRS2279可使ATP在hESCs的作用消除80％-90％，而对CVPCs完全无作用;P2Xs及P2Y1激动剂2MeSATP可激发约100％ hESCs的钙反应，并可被MRS2279完全消除;P2Y1特异性激动剂MRS2365可激发90％以上hESCs有钙反应;2MeSATP和MRS2365只触发较低或无法引起CVPCs中钙反应;　　(5)IP3R3KD的hESCs对ATP和UTP的反应性显著下降，而对ADP和MRS2365的反应性没有显著变化;而其分化的CVPCs对ATP的反应性不变，而对UTP的浓度-反应曲线发生右移（P＜0.01，EC50值变大）。IP3R2KO的hESCs对ATP，UTP，ADP，MRS2365的反应性均显著下降;其分化的CVPCs对ATP和UTP的浓度-反应曲线均发生显著右移（P＜0.001，EC50值变大），表明IP3R2KO降低CVPCs对ATP和UTP的敏感性。　　结论:　　(1)hESCs和CVPCs对胞外核苷酸刺激具有特异的钙反应性，这一特性与其具有的P2R表达组合相一致;　　(2)明确了P2Y1在hESCs中是占主导作用的P2R亚型，P2Y2,4,6在CVPCs中的作用显著提高;　　(3)这两类细胞中，P2X受体在核酸诱导的钙活动中的贡献可以忽略不计;　　(4)IP3Rs与P2YRs的偶联具有亚型特异性的特点;　　(5)与hESCs相比CVPCs中存在更强的P2Rs-IP3Rs偶联，以实现更快速和大量的钙释放。