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酶是生物燃料技术发展中的关键一环,酶的高催化活性和高热稳定性是工业生产中所期望的品质,提高酶的催化活性和热稳定性对酶的工业化应用具有重要的意义。目前对于酶的工程改造主要有理性改造、非理性改造、和半理性改造三种策略。酶的理性改造可以极大地降低实验的工作量,但是成功率比较低。随着生物信息学的发展及对蛋白结构的深入认识使得酶理性改造的成功率得到了很大的提高。本研究通过生物信息学分析及蛋白工程改造,提高了 β-葡萄糖苷酶TrCel1b和PET水解酶IsPETase的催化活性和热稳定性。TrCel1b蛋白是一种来自里氏木霉(Trichodermareesei)的β-葡萄糖苷酶,它能够以葡萄糖为底物合成二糖,但是它的合成活性非常低,限制了它在工业上的应用。为了提高β-葡萄糖苷酶TrCel1b的催化活性和热稳定性,本研究通过对TrCel1b蛋白的三维结构进行分析,提出了基于疏水指数的HIFFA策略来提高TrCel1b蛋白催化活性,同时我们提出了 C末端介导的多聚化策略来增强TrCel1b蛋白的热稳定性,接着我们将两种策略结合来提高TrCel1b蛋白催化活性,最后我们将C末端介导的多聚化策略应用到了 IsPETase蛋白的理性改造中。基于疏水指数的HIFEA策略和C末端介导的多聚化策略为其它酶的理性改造提供了一个新的借鉴。主要的研究结果如下:1 TrCel1b蛋白的合成活性改造通过反转录技术获得了 β-葡萄糖苷酶TrCel1b的基因序列,其长度为1455 bp,共编码484个氨基酸,实现了 β-葡萄糖苷酶TrCel1b在大肠杆菌中的高效异源表达。通过TrCel1b蛋白与纤维二糖的分子对接,我们发现纤维二糖分子处在一个由许多亲水性的氨基酸残基形成的亲水的环境中,但是其周围也存在一些疏水性的氨基酸残基,据此我们提出了一个假说:TrCel1b蛋白催化位点中关键氨基酸的疏水指数与二糖的合成活性相关,催化位点中关键氨基酸疏水指数的下降可能有利于二糖的合成。根据假说,我们提出了一个基于疏水指数的(Hydropathy Index For Enzyme Activity)的HIFEA策略来提高酶的催化活性。根据该策略,我们将TrCel1b蛋白催化位点中疏水性氨基酸突变为亲水性氨基酸,设计了TrCel1bW173H,TrCel1bI174S,TrCel1bI177S,TrCel1bI177S/I174S,TrCel1bI177S/I174S/W173五个正向突变体蛋白。同时,我们将TrCel1b蛋白催化位点中亲水性氨基酸突变为疏水性氨基酸,设计了一个反向突变体蛋白TrCel1bN240I。酶学性质分析表明TrCel1b,TrCel1bW173H,TrCel1bI174S,TrCel1bI177S,TrCel1bI177S/I174S,TrCel1bI177S/I174S/W173H蛋白的最大的总二糖合成产量分别达到了 44.0,32.9,80.2,148.8,152.9,195.8 mg/ml/mg 酶。与野生型 TrCel1b蛋白相比,TrCel1 bI177S/I1 74S/W173H蛋白的总二糖的产量提高了 3.5倍,而反向突变体TrCel1bN240I失去了二糖合成活性。这种基于疏水指数的HIFEA策略为酶的催化活性改造提供了一个新的参考。2 TrCel1b蛋白的热稳定性改造为了提高β-葡萄糖苷酶TrCel1b的热稳定性,我们对比了耐热的β-葡萄糖苷酶的三维结构,发现大多数耐热β-葡萄糖苷酶都形成了多聚体。接着我们通过序列对比发现超耐热的β-葡萄糖苷酶PfCelB的C末端序列比TrCel1b蛋白的C末端序列多出了一段。文献研究表明酶的C末端的序列与其热稳定性有关,我们推测β-葡萄糖苷酶的多聚化可能有利于其抵抗高温带来的热变性胁迫。因此我们提出了一个假说:蛋白的多聚化状态与其热稳定性有关,通过C末端序列替换可以改变蛋白的多聚化状态。基于这个假说,我们提出了 C末端介导的多聚化策略。通过将来自超嗜热β-葡萄糖苷酶PfCelB的C末端不同长度的氨基酸序列替换到了 TrCel1b 蛋白 C 末端,设计了 TrCel1b-H5,TrCel1b-H9,TrCel1b-H13,TrCel1b-H17蛋白等5个突变体蛋白。酶学性质分析表明TrCel1b,TrCel1b-H5,TrCel1b-H9,TrCel1b-H13 和 TrCel1b-H17 蛋白最适催化 pH 分别为 6,6,7,7和7;最适催化温度分别为20℃,20℃,10℃,75℃和30℃;在65℃时热稳定性半衰期分别为0.22 h,0.22 h,0.22 h,118.20 h,0.22 h;在65℃时的比酶活分别为 0.02,0.48,0.10,64.46,0.12 U/mg。与野生型 TrCel1b 蛋白相比,TrCel1b-H13蛋白的最适催化温度提高了 55℃,Tm值提高了 20℃,在65℃时的热稳定半衰期提高了 537倍,水解活性提高了 3223倍。为了探究TrCel1 b-H13蛋白热稳定性提高的分子机制,我们对TrCel1b-H13蛋白进行了结晶,结果表明TrCel1b-H13蛋白是一个中心对称的三聚体结构。定点突变表明位于TrCel1b蛋白相邻亚基的接触面上的E28,H60,E99,K106,K471等五个氨基酸位点与TrCel1b-H13蛋白热稳定性有关,它们通过氢键和疏水相互作用维持着TrCel1b-H13蛋白的三聚体结构。这种通过C末端介导的多聚化来提高TrCel1b蛋白热稳定性的策略为提高其它酶的热稳定性提供了一个新的借鉴。3 TrCel1b-H13蛋白的催化活性改造通过将基于疏水指数的HIFFA策略和C末端介导的多聚化策略结合,我们设计了 TrCel1bI177S/I174S/w173H-H13蛋白。它能够以葡萄糖为底物合成昆布二糖、槐糖和纤维二糖。在30℃时TrCel1bI177S/I174S/W173H-H13蛋白最大二糖合成活性为47.9 mg/ml/mg酶,水解活性为0.003 U/mg。与TrCel1bI177S/I174S/W173H蛋白相比,TrCel1bI177S/I174S/W173H-H13蛋白在45℃时的合成活性提高了一倍,这表明TrCel1bI177S/I174S/W173H-H13蛋白的合成活性与C末端序列有关。我们推测C末端序列的替换可能提高了 TrCel1 bI177S/I174S/W173H-H13蛋白的热稳定性,进而提高了其在45℃时的催化活性。4 IsPETase蛋白的理性改造IsPETase蛋白由873个核苷酸编码的290个氨基酸组成,其相对分子质量为27.6 kDa,等电点为9.41,具有由8个α/β片层(sheet)构成的核心结构。通过对IsPETase蛋白的氨基酸序列及其三维结构进行分析,设计了基于loop替换、B-factor及C末端介导的多聚化的策略。实验结果表明C末端介导的多聚化策略优于Loop替换和B-factor策略。其中IsPETase,IsPETase-H17蛋白的最适催化温度都为35℃,在45℃(10 d)时IsPETase,Is PETase-H9蛋白的PET降解产物分别达到了 0.005,0.028 mg/ml。与野生型IsPETase蛋白相比,IsPETase-H9蛋白的Tm值和催化活性分别提高了 20.6℃和4.1倍。IsPETase-H9蛋白可能通过形成了二聚体提高了热稳定性,进而提高了IsPETase-H9蛋白的催化活性。三维结构分析表明其替换的C末端序列形成的α-helix结构与相邻亚基形成的氢键和疏水相互作用对维持IsPETase-H9蛋白的热稳定性的起到了重要作用。