目的:本研究旨在通过构建小鼠肾移植模型,研究外源性过表达Nrp1的树突状细胞(DC)在小鼠肾移植免疫耐受中的作用,以丰富移植免疫耐受的理论基础,探索临床预防和治疗肾移植排斥反应的新靶点。方法:1.调研评价有关小鼠肾移植技术的全部中、英文文献。检索Embase、PubMed、Cochrane Library 3个英文数据库及Sinomed、CNKI、万方、VIP4个中文数据库。设立纳入排除标准,2名研究员独立筛选并纳入相关文献并提取作者、国家、麻醉方式、动静脉吻合方法、泌尿系统吻合方法、技术贡献等信息。根据文献内容进行归纳总结与定性评价,为下一步小鼠肾移植手术提供理论基础;2.为探索适合初学者的小鼠肾移植技术训练方法及手术技巧,首先进行显微外科缝合技巧训练。外科显微镜下采用8针缝合法进行软管及大鼠尾动脉缝合训练。熟悉显微外科操作后,借助第一部分积累的理论基础,进行小鼠肾移植手术。采用C57BL/6雄性小鼠,8～10周龄,随机供受体。移植手术包括两种手术方式。手术方式1共进行70例手术,移植肾静脉采用下腔静脉(下腔静脉组),缝合方式为容氏微血管缝合法;移植肾动脉采用主动脉瓣斜切口,缝合方式为容氏微血管缝合法(连续缝合组),观察小鼠术后血栓、出血、肾积水等并发症情况以及存活情况;手术方式2共进行20例手术,移植肾静脉直接采用肾静脉(肾静脉组),采用容氏微血管缝合法;移植肾肾动脉处理同手术方式1,采用间断缝合法(间断缝合组)。所有移植小鼠泌尿系统重建均采用输尿管植入法。选取手术方式1中后20例与手术方式2中20例手术,分别比较下腔静脉组和肾静脉组、动脉连续缝合组和间断缝合组的出血、血栓发生率及缝合时间,以探索适合初学者的小鼠肾移植模型技术,为下一步移植免疫研究提供理想的模型动物;3.小鼠骨髓来源的DC随机分为3组,通过腺病毒干预后分别为DC组、GFP-12-DC组和Nrp1-GFP-12-DC组。流式分析各组DC表型变化,并用MTT法分析各组DC对T淋巴细胞增殖的影响。以C57BL/6J(H-2Kb)小鼠为受鼠,随机分为4组,术前 3 天分别给予静脉注射 100μl 的 PBS、DC(2×106/ml)、GFP-DC(2×106/ml)和Nrp1-GFP-DC (2×106/ml)进行预处理。以BALB/c (H-2Kd)小鼠为供体建立生命支持型肾移植模型。排除移植效果不佳或术后出现外科并发症的移植小鼠,每组共移植9只小鼠。每组随机选取6只观察受鼠生存情况;每组另外3只术后14天处死摘取供肾,观察移植肾组织病理改变,并检测移植肾组织中Nrp1、IL-10、IFN-γ mRNA和蛋白的表达情况。结果:1.共纳入24篇相关文献,其中中文8篇,英文16篇。2011年～2015年累计发表12篇,占所有文献数量的50%。中国、美国和澳大利亚是文献发表数量前3名的国家。文献内容主要涉及小鼠肾移植模型类型、血管吻合技术、泌尿系统重建技术、补液、术后护理或学习曲线等,其中重点介绍血管吻合和泌尿系统重建的文章较多,分别占34%和38%。有2篇文献描述了小鼠肾移植建模的学习曲线,有3篇提供了手术视频。有不少文献未指明供、受鼠品系,未明确麻醉、镇痛、抗感染等药物的浓度剂量、用药途径、用药频次,未描述缝合线规格及缝合方式等。2.软管缝合训练1周后,缝合速度可达到2.2±0.31min/针,此阶段可熟悉显微缝合的基本方法。大鼠尾动脉缝合训练2周,第11、13天时缝合速度基本稳定,分别为1.3±0.36min/针、1.1±0.23min/针,此阶段可进一步提升显微外科技巧。熟悉显微外科技术要领后可进行小鼠肾移植建模。用手术方式1,在第20例时获得第1只移植成功的小鼠,共移植成功28例。失败手术中,致死性出血7例(10%),血管狭窄2例(2.9%),血栓形成31例(44.3%),肾积水2例(2.9%)。最后10例小鼠移植建模成功率(术后存活>7天)为80%,长期生存率(术后存活>30天)达到70%,供肾热缺血时间为28.6±3.1min,冷缺血时间为29.7±2.3min,供鼠手术用时30.1±3.9min,受鼠手术用时53.2±5.7min。手术方式1、2比较发现,肾静脉组或下腔静脉组术后血管并发症发生率差异无统计学意义;动脉吻合中,间断缝合组血栓发生率与连续缝合组差异无统计学意义,但缝合时间显著延长,且术后出血发生率较高。3.各组DC表型分析,Nrp1-GFP-12-DC 组 CD83+、CD86+和MHC-Ⅱ+DC比例分别为 19.96±3.77%、18.54±1.74%和 10.55±0.94%,低于 12-DC组 (33.72±1.10%、42.47±5.27%、29.40±0.80%)和 GFP-12-DC 组(45.11±1.44%、36.09±2.17%、31.34±1.34%),差异具有统计学意义(P<0.05),结果表明Nrp1过表达抑制了 DC的成熟(P<0.05)。MTT法表明过表达Nrp1后,DC刺激T淋巴细胞增殖的能力受到抑制。过继回输实验发现,PBS组受鼠在1月内全部死亡,PBS组、DC组、DC-GFP组和Nrp1-GFP-DC组中位生存时间分别为25天、30天、32天和48天。Nrp1-GFP-DC组受鼠较其他各组生存时间明显提高,移植肾损伤程度与炎症细胞浸润最轻,供肾中IFN-y表达下调和Nrp1、IL-10表达上调(P<0.05)。结论:1.当前,小鼠肾移植模型重获吸引力,但相关文献仍较少,且技术改进多未经大规模使用、验证及对比。此外,文献在介绍用药剂量、给药途径、缝合方法等内容时需进一步明确规范。可以看到,虽经技术的不断改进,小鼠肾移植仍然是一项具有挑战性的技术。本部分总结了小鼠肾移植血管吻合、泌尿系统重建等关键外科技术,为下一步建立小鼠肾移植模型打下了理论基础;2.比较同类文献大约需要近40例小鼠肾移植模型才能获得成功,该训练和手术方法能够迅速提高术者显微操作基本功,缩短初学者建立小鼠肾移植模型的学习曲线,成功率较高,为下一步移植免疫研究提供了技术支持;3. Nrp1过表达可维持DC非成熟状态,使其刺激T淋巴细胞增殖的能力下降;过继回输过表达Nrp1的DC能降低受鼠移植肾的炎性反应,延长受鼠肾移植术后存活时间。