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破骨细胞(osteoclast, OC)是体内唯一行使骨吸收(bone resorption)功能的细胞,其分化增殖活跃或活性的亢进会引起多种骨骼疾病。OC的分化及其功能的发挥受体内多种因子的影响,比如核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-icB ligand, RANKL),核因子-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-KB, RANK)以及骨保护素(osteoprotegerin, OPG)等。大量研究表明,"RANKL/RANK/OPG"系统是OC分化过程中重要的信号通路,其中成骨细胞(osteoblast, OB)分泌的RANKL与OPG通过竞争性地与OC前体细胞(osteoclast precursor cell, OPC)及OC表面的RANK结合,调控OC的分化。研究表明,维生素D在体内的主要活性形式1α,25-(OH)2D3可调节OB分泌的RANKL与OPG,间接调节骨代谢。除此之外,大量研究表明,OPC及OC能够表达维生素D受体。然而,维生素D直接调控OC形成和活化的机制仍不十分清楚。本研究以RAW264.7细胞作为OPC,在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)与RANKL联合诱导形成OC的基础上,添加不同浓度1α,25-(OH)2D3(10-7,10-8及10-9mol/L),观察其对OC形成、骨吸收活性、OC相关功能蛋白(整合素αvβ3、V-ATPase、CAⅡ、CTSK、TRAP、MMP-9)及关键转录因子(c-Fos、 NFATc1)表达的影响,旨在揭示维生素D调控OC分化及活化的机制。1.诱导RAW264.7细胞分化为OC方法的建立在RAW264.7细胞培养过程中,添加25μg/L M-CSF和不同浓度RANKL (0、10、30、50和100μg/L)诱导培养。采用MTT法测定RAW264.7细胞增殖率、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色及骨片吸收陷窝鉴定OC的形成。结果显示,M-CSF及不同浓度RANKL联合均可抑制RAW264.7细胞增殖,剂量依赖性地促进OC形成和活化,其中25μg/L M-CSF与30μg/L RANKL联合可诱导出大量满足分子生物学研究的OC。2.1α,25-(OH)2D3对OC形成及骨吸收活性的影响为探讨1α,25-(OH)2D3对OC形成和活化的影响,在25μg/L M-CSF及30μg/L RANKL诱导RAW264.7细胞形成OC的基础上,添加不同浓度1α,25-(OH)2D3(0、10-7、10-8、10-9mol/L)及无水乙醇溶剂对照。采用MTT法测定RAW264.7细胞增殖率,TRAP染色计数鉴定OC形成,骨吸收陷窝分析检测OC活性。结果显示,无水乙醇溶剂对RAW264.7细胞增殖和分化无明显影响,而不同浓度1α,25-(OH)2D3均可抑制RAW264.7细胞增殖,促进OC形成及骨吸收活性,其中10-8mol/L1α,25-(OH)2D3效果最明显。说明,1α,25-(OH)2D3可诱导OC形成和活化。3.1α,25-(OH)2D3对OC相关功能蛋白表达的影响为探讨1α,25-(OH)2D3对OC形成和活化相关功能蛋白整合素αvβ3、V-ATPase、CAⅡ、 CTSK、TRAP及MMP-9表达的影响,在25μg/L M-CSF及30μg/L RANKL诱导RAW264.7细胞形成OC的基础上,添加不同浓度1α,25-(OH)2D3(0、10-7、10-8、10-9mol/L),通过Western Blot检测OC形成与活化相关功能蛋白的表达。结果显示,1α,25-(OH)2D3作用早期(24、48h)均可增强OC整合素αvβ3、V-ATPase、CAⅡ、CTSK、TRAP及MMP-9的表达,其中10-8mol/L1α,25-(OH)2D3效果最显著。随着OC培养时间延长(72h),1α,25-(OH)2D3组OC整合素αvβ3、V-ATPase、CAⅡ、CTSK、TRAP及MMP-9的表达下调。说明,1α,25-(OH)2D3诱导OC形成和活化过程中,能够促进相关功能蛋白的表达。4.1α,25-(OH)2D3对OC关键转录因子表达的影响为探讨1α,25-(OH)2D3对OC形成和活化过程中关键转录因子c-Fos及NFATc1表达的影响。在25μg/L M-CSF及30μg/L RANKL诱导RAW264.7细胞形成OC的基础上,添加不同浓度1α,25-(OH)2D3(0、10-7、10-8、10-9mol/L),采用Q-RT-PCR技术检测OC关键转录因子c-Fos及NFATc1的表达。结果显示,10-8mol/L1α,25-(OH)2D3作用早期(24h)均能上调OC关键转录因子c-Fos及NFATc1的表达；随着OC培养时间延长(24、72h),1α,25-(OH)2D3组OC关键转录因子c-Fos及NFATc1的表达下调。说明,1α,25-(OH)2D3诱导OC形成和活化过程中,能够促进关键转录因子的表达。