论文部分内容阅读
目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种晚期炎症因子和免疫调节分子,在脓毒症免疫紊乱发生中具有重要作用,研究其免疫调节效应及机制将有助于深化对脓毒症致病机制的认识。新近发现,线粒体融合蛋白2(Mfn2)与介导T淋巴细胞活化、增殖、极化的重要信号通路Ca2+途径关系密切,并可能由此而参与HMGB1对CD4+T淋巴细胞免疫功能的调节过程。本项目通过体外实验研究HMGB1对CD4+T细胞免疫功能及Mfn2表达的影响,并通过基因转染技术调节Mfn2表达,探讨Mfn2在HMGB1调节CD4+T细胞免疫功能中的作用。同时进一步观察Ca2+-NFAT信号途径的变化来分析Mfn2介导CD4+T细胞免疫功能改变的机制。预期为脓毒症的免疫调控治疗提供新的理论依据和潜在靶标。
方法:分离正常小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,在含10％胎牛血清的1640培养基中调整细胞浓度为2×106/ml后置于24孔培养板。实验一:应用HMGB1刺激,观察CD4+T淋巴细胞的增殖反应,同时观察IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白的表达时间/剂量效应关系。实验二:HMGB1刺激后,采用Real time-PCR法检测Mfn2的表达,通过基因转染技术调节Mfn2表达后观察CD4+T淋巴细胞的增殖反应及IL-2蛋白表达、功能性极化(IFN-γ/IL-4)的情况。实验三:基因转染调节Mfn2表达后,给予ConA或(和)HMGB1刺激,通过流式细胞术检测胞浆游离钙离子水平,同时检测NFAT活性的改变。
结果:1.HMGB1对小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞免疫功能的影响:(1)与正常对照组相比,1000ng/ml剂量的HMGB1作用24h或48h后,CD4+T淋巴细胞增殖能力明显受到抑制,其他剂量和时间未见显著改变。(2)10ng/ml剂量的HMGB1作用24h能够促进CD4+T淋巴细胞IL-2的产生,随着剂量的增加其效应逐渐衰竭。100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1作用48h均能导致IL-2产生减少。(3)在24h时间点,10ng的HMGB1作用能够促进Th1比例的增加(P<0.05),但100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1作用,明显增加了Th2比例(IFN-γ//IL-4比值减小,P<0.05或P<0.01)；1000ng/ml的HMGB1作用48h能够促进Th2比例的增加,同时间点其他剂量未见明显改变。2.Mfn2在HMGB1介到CD4+T淋巴细胞免疫功能改变中的作用。(1)ConA刺激后Mfr02 mRNA的表达有所增强。1000ng/ml的HMGB1刺激12h能够促进Mfn2的表达(P<0.01),但在24h时间点,却显示出相反的效应,能够明显抑制Mfn2 mRNA的表达(P<0.01)。在48h时间点,100ng/ml、1000/ml的HMGB1均能够能够抑制Mfn2 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。(2)在未给予HMGB1刺激的情况下,过表达Mfn2导致细胞增殖能力明显下降(P<0.01),HMGB1刺激能够抑制ConA诱导的细胞增殖(P<0.01),过表达Mfn2能够减轻HMGB1对CD4+T细胞增殖的抑制作用。(3)在未给予HMGB1刺激的情况下,过表达Mfn2导致细胞IL-2的生成明显下降(P<0.01),HMGB1刺激能够抑制ConA诱导的细胞活化过程中IL-2的产生(P<0.01),过表达Mfn2能够减轻HMGB1对CD4+T细胞增殖的抑制作用(P<0.01)。(4)单纯过表达Mfn2未能引起Th1/Th2的改变,HMGB1能够促进CD4+T细胞向Th2漂移,过表达Mfn2能够减轻这种效应(P<0.05)。3.Mfn2在HMGB1介到CD4+T淋巴细胞免疫功能改变中的作用机制。(1)在未给予HMGB1刺激的情况下,过表达Mfn2导致细胞胞浆钙离子水平明显下降(P<0.01)；HMGB1刺激能够抑制细胞活化过程中胞浆钙离子水平的提高(P<0.01),过表达Mfn2能够减轻HMGB1对CD4+T细胞活化过程中胞浆钙离子提高的抑制作用(P<0.01)。(2)在未给予HMGB1刺激的情况下,过表达Mfn2导致细胞NFAT活性下降(P<0.01)；HMGB1刺激能够抑制细胞活化过程中NFAT活性的提高(P<0.01),过表达Mfn2能够减轻HMGB1对CD4+T细胞活化过程中NFAT活性提高的抑制作用(P<0.01)。
结论:1.HMGB1对CD4+T淋巴细胞的增殖、分化和细胞因子分泌等免疫功能均有直接调节效应。HMGB1剂量蓄积和刺激时间延长能诱导CD4+T细胞功能亚群由Th1向Th2转化,在脓毒症发病过程中,这一效应可能是导致免疫麻痹的重要因为之一。2.HMGB1能够抑制Mfn2的表达,维持Mfn2的表达水平能够减轻HMGB1对CD4+T淋巴细胞免疫功能的抑制作用。提示Mfn2参与了HMGB1对CD4+T细胞免疫功能调节过程,其表达下降是CD4+T细胞免疫功能损害的重要因素；3.Mfn2表达改变对CD4+T细胞免疫功能的影响至少部分是通过Ca2+-NFAT信号通路实现的。