研究背景： 在外科危重病人中常常遇到高血糖，很大的因素是应激性高血糖以及许多糖尿病病人，血糖持续升高可对机体产生一系列的不良反应，增加机体高渗性昏迷、糖尿病酮症酸中毒发生的可能性，严重危及生命。高血糖的发生提示机体处于代谢紊乱状态，其持续存在更增加了感染的风险。因此如何应对创伤伴随高血糖并发症的出现，一直是创伤外科亟待解决的问题。创面损伤修复时，创伤组织的高糖环境对成纤维细胞的生长有着很大影响，使得创面愈合这一过程变得更为复杂。 创伤愈合是一个复杂而有序的生物学过程，涉及炎症反应、细胞增殖、迁移，创面重塑等多个序贯又相互交叉的病理生理过程。研究已发现成纤维细胞（fibroblast）在此修复过程中起着十分重要的作用。长期以来它也一直被视为是肉芽组织收缩的能量供应者，对伤口有效而迅速的关闭起着重要的作用。尔后提出了肌成纤维细胞细胞的概念，肌成纤维细胞被认为是由创口周围的皮肤、皮下组织中的成纤维细胞在各种刺激因子的作用下转变而来，其分泌的肌动蛋白（α—smooth muscle actin，α—SMA）被普遍认为是肌成纤维细胞表型的可靠证据。 创伤后引起的高血糖对于创面愈合有着十分重要的影响，普遍认为高血糖会影响创面的愈合，然而却没有关于高糖环境对于成纤维细胞生物功能影响的细胞分子生物学研究以及成纤维细胞和肌成纤维细胞细胞在高糖环境下的关系的研究。 本实验即是利用体外培养小鼠成纤维细胞，在体外模拟高血糖的环境，设定不同糖浓度，探讨不同时间下成纤维细胞生长增殖情况和胶原合成情况以及其和肌成纤维细胞细胞之间的关系，进行基础性研究。 实验目的： 1．体外培养和鉴定小鼠皮肤成纤维细胞。 2．研究不同糖浓度和时间下成纤维细胞生长增殖情况和胶原合成情况。 3．研究不同糖浓度培养液条件下成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的情况 实验方法： 将昆明小鼠断颈处死后，在其背部用备皮刀将毛刮净后酒精消毒，取1cm×1cm大小的皮肤，用消毒剪剪下皮肤后，用生理盐水洗净，剪碎后用1％胶原酶溶液37℃水浴下作用10分钟，然后用100目的金属网筛过滤，取过滤液用试管1000转/分下离心，弃上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培养液（糖浓度为25mmol/L）将沉淀溶解，并放入培养皿中培养，成纤维细胞约3小时后即可贴壁生长，待细胞贴壁后即刻弃上清，用10％胎牛血清的高糖DMEM培养液继续培养，待细胞贴壁生长后传代数次，纯化后得到小鼠皮肤成纤维细胞。在基础培养液中加入一定量的左旋葡萄糖，配成配置成糖浓度梯度为25，40，55，70，85 mmol/L的培养液，其渗透压计算后分别为（5311 mmHg，5603 mmHg，5896 mmHg，6181 mmHg，6474 mmHg），在正常值511～6227 mmHg范围内或稍高。依次为A，B，C，D，E五个糖浓度组，分别进行成纤维细胞的培养，利用爬片法进行细胞免疫组织化学法鉴定成纤维细胞；然后使用CCK—8方法测定不同糖浓度培养液培养12h、24h和48h成纤维细胞增殖情况，用Elisa方法测定不同糖浓度培养液培养12h、24h和48h成纤维细胞分泌I型胶原的情况；最后用Western—blot方法测定不同浓度培养液培养12h、24h和48h后成纤维细胞肌动蛋白（α—SMA）的含量。 结果： 1．成纤维细胞免疫组织化学法鉴定含有Ⅰ型胶原的成纤维细胞被染成棕色，细胞成多边形和长梭形，细胞较大，且镜下几乎均为染色的细胞；证实原代培养的细胞中成纤维细胞为主，且纯度较高，细胞间未观察到有被染色的Ⅰ型胶原 2．利用CCK试剂盒测定成纤维细胞的增殖，OD值和细胞数目成正比。结果如表1所示：（1）在相同培养时间条件下，随着糖浓度的增加（大于40mmol/L），成纤维细胞数目进行性减少（P<0．01）：（2）在24，40mmol/L培养浓度下，随着培养时间的增加，成纤维细胞的数目逐渐增加；（3）在55，70，85 mmol/L培养浓度下，成纤维细胞的数目无明显变化。 3．利用Elisa试剂盒测定细胞外Ⅰ型胶原，结果显示每组均可检测到细胞外Ⅰ型胶原的存在，统计结果显示其每组的成纤维细胞产生Ⅰ型胶原在相同时间不同培养浓度下的总量并无明显差别（P>0．05）。 4．对细胞进行既定处理后，对成纤维细胞肌动蛋白的表达做了半定量测定，随着浓度的增加，成纤维细胞中表达肌动蛋白的量是上升的。 结论： 1．利用胶原酶消化法原代分离和培养皮肤成纤维细胞的方法是可行的，并且可以得到纯度较高的成纤维细胞。细胞免疫组织化学法鉴定成纤维细胞时未发现细胞间Ⅰ型胶原纤维，Ⅰ型胶原纤维可以通过组织液吹打的方法收集。 2．随着细胞培养液糖浓度的升高，在糖浓度40mmol/L的范围内，随着糖浓度升高，成纤维细胞的增殖不受影响，随着糖浓度的进一步升高，成纤维细胞的增殖速度明显下降，高糖浓度可以抑制成纤维细胞的增殖（P<0．01）。 3．随着糖浓度的升高，成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原纤维的量并无太大变化（P>0．05），但是在相同培养时间条件下，随着糖浓度的增加（大于40mmol/L），成纤维细胞数目进行性减少（P<0．01），故糖浓度大于40mmol/L时，成纤维细胞分泌I型胶原的功能是增强的。 4．随着糖浓度的升高，成纤维细胞产生肌动蛋白的量呈上升趋势，成纤维细胞向肌成纤维细胞细胞的转化增强。