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目的:通过构建人TSLCl(肺阻抑因子-1)基因的重组表达质粒,将其转导入人恶性黑素瘤细胞株A375中,建立稳定表达TSLC1基因的人恶性黑素瘤细胞系,观察TSLCl的高表达对A375细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为的影响,进而探讨TSLCl基因在恶性黑素瘤发生发展的作用。
方法:(1)采用免疫组化法观察TSLCI基因在色素痣和恶性黑素瘤中的表达。(2)采用甲基化PCR的方法研究TSLCl基因在恶性黑素瘤中缺失的原因。(3)采用RT-PCR方法,以人正常肝组织中提取的总RNA为模板扩增TSLCl全长片段,克隆至pCDNA3.1-myc(-)-His真核表达载体。限制性酶双酶切及测序鉴定pCDNA3.I-TSLCl重组质粒。用脂质体转染的方法将表达载体稳定转染至人恶性黑素瘤细胞株A375,经克隆化培养以及G418筛选,建立了5株稳定表达TSLC1蛋白的细胞系。(4)选用稳定表达TSLCl基因的恶性黑素瘤细胞株A375为研究对象。转染空载体的细胞系A375和未经处理的A375细胞株设为对照,MTT法检测A375细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化,细胞凋亡的发生;Transwell检测A375细胞株的体外侵袭和迁移能力。
结果:(1)随着恶性黑素瘤病理分级的增高,TSLC1基因的表达明显减少(P=0.032 and P=0.0021,)(2)成功获得高表达TSLCI的稳定细胞系。(3)与对照组和空白组相比,实验组细胞株细胞生长速度减慢,增殖受到明显抑制;实验组细胞周期发生了明显的Go/G1期阻滞;实验组细胞凋亡率明显升高(P<0.01);体外侵袭和迁移能力受到较大抑制(P﹤0.05)。
结论:(1)TSLCl基因甲基化是TSLCl基因在恶性黑素瘤中缺失表达的原因之一。(2)成功构建了稳定表达TSLCl的A375细胞系。(3)TSLCI基因能明显抑制A375细胞的增殖和侵袭,并诱导细胞发生凋亡。(4)TSLCl基因沉默表达是恶性黑素瘤发生发展的一个重要原因,可以作为判断恶性黑素瘤预后的指标之一。