研究目的和意义多囊卵巢综合征(polycysitic ovary syndrome, PCOS)是育龄妇女中最常见的妇科内分泌失调性疾病,发病率占全球育龄女性的5%-10%,占无排卵性不孕症患者的30%-60%。此外,PCOS患者还较易发生糖尿病、心血管疾病以及子宫内膜癌等远期并发症。可见,PCOS是关乎女性一生的内分泌和代谢紊乱性疾病。但当前关于PCOS病因学、诊断标准和最佳治疗方案却还存在许多争论和悬而未决的问题,使PCOS成为研究热点,而研究的重中之重是PCOS病因学的研究。因高雄激素血症是PCOS的主要病理生理特征,与雄激素合成和雄激素转化相关酶的基因成为研究PCOS的靶基因。P450芳香化酶为卵巢颗粒细胞上催化雄激素转化为雌激素的限速酶,是CYP19基因表达的产物,因此CYP19基因成为研究PCOS的靶基因之一。目前,关于CYP19基因在PCOS妇女卵巢组织中的表达水平存在争议,有文献报道CYP19基因表达降低,而有的文献报道表达增高。CYP19基因表达降低则P450芳香化酶产生减少,可导致雄激素向雌激素转化减少以至于雄激素水平升高；而CYP19基因表达升高则P450芳香化酶产生增加,理论上由于其转化雄激素的能力增强雄激素水平应降低,但矛盾的是PCOS患者血清雄激素水平升高。在卵巢颗粒细胞,芳香酶编码基因CYP19的表达主要受卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)的调节,同时前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)等也可促进CYP19的表达。FSH的作用是通过卵巢上相应的FSH受体(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR)所介导,目前研究发现,大多数PCOS患者的FSH水平正常,而针对FSHR的表达有文献报道其水平升高。近年研究发现,FSH对CYP19表达的调节作用是通过转录因子GATA-4介导的,因此,在FSH水平正常且FSHR的表达升高的情况下也有可能因转录因子GATA-4表达异常而导致CYP19表达异常,同时PGE2对CYP19表达的刺激作用也是由转录因子GATA-4介导的,所以GATA-4在调节CYP19表达中可能起到关键性作用。更加值得注意的是,转录因子GATA-4在卵泡发育过程中激活许多基因的转录,包括抑制素、抗苗勒管激素、类固醇激素合成急性调控蛋白,而这些产物均有研究证明在PCOS的发生中起着至关重要的作用。根据文献检索,目前国内外尚未见有关GATA-4基因与PCOS发生相关的研究报道,GATA-4基因在PCOS患者和正常女性卵巢中的表达水平是否存在差异也不清楚。因此,有必要对CYP19、GATA-4和FSHR三种基因在PCOS卵巢中的表达水平及作用进行探讨。本研究拟以CYP19、GATA-4和FSHR为研究对象,首先采用病例对照的研究形式初步检测三种基因在PCOS患者卵巢中的表达水平。由于取材条件的限制,很有必要建立一个与PCOS妇女卵巢组织中CYP19表达相一致的模型来进一步研究这三种基因的作用及其相关性。由于来曲唑直接作用于P450芳香化酶,且其诱导的PCOS大鼠模型具有与人类PCOS患者极其相似的卵巢结构方面的改变,故本研究以来曲唑建造PCOS大鼠模型,检测该PCOS大鼠模型卵巢组织中三种基因的表达水平,并对模型中三种基因表达间的相关性进行研究,同时也为该模型的应用提供一定的理论依据。第一章：CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在PCOS患者卵巢组织中的表达及其临床意义目的：研究CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在PCOS患者卵巢中的表达特点,为进一步探讨CYP19、GATA-4和FSHR与PCOS发生的关系奠定基础。研究方法：1.标本来源与分组收集南方医院、佛山市第一人民医院、福州军区总院符合鹿特丹诊断标准的多囊卵巢综合症患者16例。对照组9例,因单侧卵巢肿瘤行对侧卵巢剖探术,或因子宫肿瘤行子宫及双侧附件切除术。两组患者年龄无显著性差异。所有组织均用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,分别进行HE染色和免疫组化检测。2.免疫组织化学方法检测CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在卵巢组织中的表达卵巢组织常规石蜡包埋,2um切片行HE染色。5um切片行免疫组织化学染色。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,微波修复抗原,10%山羊血清室温封闭,一抗孵育过夜,DAKO anti mouse, rabbit二抗室温孵育30分钟／DAKO anti-goat immunoglobulins/HRP二抗室温孵育,DAB显色,苏木精复染后,1%盐酸酒精分化,脱水,透明,中性树胶封片。3.结果判定CYP19和FSHR蛋白表达以棕黄色颗粒为阳性。染色强度以阳性细胞呈现的染色特征为标准进行计分：细胞未染色记为0分,呈淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分；GATA-4蛋白的表达产物定位于细胞核,由于采用了苏木精复染,阳性细胞核大部分表现为棕黑色。染色特征标准计分为：细胞未染色记为0分,呈淡黑色为1分,棕黑色为2分,深黑色为3分。同样物镜下计数阳性细胞数,算出阳性细胞百分比进行计分。0～5%为0分,6～25%为1分,26～50%为1分,51～75%为3分,>75%为4分。然后根据两者相加所得的总分进行结果判定。0～1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),4～5分为中度阳性(++),6～7分为强阳性(+++)。“+～+++”为阳性表达。4.统计分析统计分析采用SPSS13.0统计软件包进行处理。计数资料两组间比较采用Mann-Whitney Test检验,p<0.05为差异具有统计学意义。结果：1. PCOS患者卵巢的窦前卵泡和窦状卵泡数目较正常卵巢增多2. CYP19在正常卵巢、多囊卵巢组织中的表达CYP19蛋白表达的阳性信号定位于颗粒细胞浆内。在早期卵泡,PCOS组16例患者中有1例(-)、2例(+)、4例(++)、9例(+++),而对照组9例中有5例(-)、2例(++)、2例(+++),经统计学分析PCOS组卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达较对照组的升高,差异具有显著性(P=0.028)；在晚期卵泡,PCOS组16例患者中有4例(++)、12例(+++),而对照组9例中有3例(++)、6例(+++),经统计学分析PCOS组卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达较对照组的略有升高,但差异不具有显著性(P=0.663)。3. GATA-4在正常卵巢、多囊卵巢组织中的表达GATA-4蛋白的表达产物定位于细胞核。在早期卵泡,PCOS组16例患者中有2例(+)、2例(++)、12例(+++),而对照组9例中有2例(-)、2例(+)、3例(++)、2例(+++),经统计学分析PCOS组卵泡颗粒细胞GATA-4蛋白表达较对照组的升高,差异具有显著性(P=0.010)；在晚期卵泡,PCOS组16例患者均为(+++),而对照组9例均为(+++),经统计学分析两组卵泡颗粒细胞GATA-4蛋白表达无显著性差异(P=1.000)。4. FSHR在正常卵巢、多囊卵巢组织中的表达FSHR表达的阳性信号定位于颗粒细胞浆内和胞膜。在早期卵泡,PCOS组16例患者中有2例(++)、14例(+++),而对照组9例中有2(++)、7例(+++)；晚期卵泡,PCOS组16例患者中有4例(++)、12例(+++),而对照组9例中有2(++)、7例(+++)。经统计学分析两组早晚期卵泡颗粒细胞FSHR蛋白表达均无显著性差异(P=0.533; P=0.878)。小结：1.在早期卵泡,PCOS组颗粒细胞CYP19蛋白表达较对照组显著性升高；在晚期卵泡,两组颗粒细胞CYP19蛋白表达无显著性差异。提示CYP19参与了早期卵泡的生长发育过程,早期卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达的过高与PCOS的发生有关。2.在早期卵泡,PCOS组颗粒细胞GATA-4蛋白表达较对照组显著性升高；在晚期卵泡,两组颗粒细胞GATA-4蛋白表达无显著性差异。提示GATA-4参与了早期卵泡的生长发育过程,早期卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达的过高与PCOS的发生有关。3. PCOS组的早期、晚期卵泡颗粒细胞FSHR蛋白表达与对照组的比较无显著性差异(P>0.05)。提示PCOS患者早期卵泡颗粒细胞GATA-4和CYP19的表达升高可能是由FSH以外的其它因素所介导的。第二章：来曲唑诱导的SD大鼠PCOS模型卵巢组织中FSHR、GATA-4和CYP19基因表达的研究目的：PCOS的主要特征是雄激素增高和持续不排卵,卵巢局部高雄激素是导致PCOS的关键原因。P450芳香化酶为卵巢颗粒细胞上催化雄激素转化为雌激素的限速酶,卵巢内此酶活性的下降导致雄激素水平升高。基于这种理论,采用芳香化酶抑制剂来曲唑给予雌性大鼠灌服,期望能够建立一种理想的PCOS动物模型,并针对模型研究FSHR、GATA-4和CYP19基因的表达水平。研究方法：1.6周龄清洁级雌性SD大鼠,随机分为2组。模型组来曲唑1mg(kg-1·d-1)溶于10g·L-1羧甲基纤维素(CMC)中,连续灌服21天。对照组给予同体积的溶剂(CMC)灌服。2.放免法测定两组大鼠血清性激素(LH、FSH、E2、P、T)水平。3.HE染色观察卵巢组织学变化。卵巢组织常规石蜡包埋,2um切片行HE染色。4.荧光定量PCR (Realtime-PCR)设计引物探针。组织液氮研磨,加入Trizol,提取总RNA,合成cDNA,荧光定量PCR,制作扩增曲线及融解曲线,得到内参、FSHR、GATA-4和CYP19基因相对拷贝数,计算FSHR、GATA-4和CYP19与内参相对拷贝数比值。比较模型组与对照组FSHR、GATA-4和CYP19基因表达的相对比值。5.免疫组织化学方法检测CYP19、GATA-4和FSHR蛋白在卵巢组织中的表达5um切片行免疫组织化学染色。切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,微波修复抗原,10%山羊血清室温封闭,一抗孵育过夜,DAKO anti mouse, rabbit二抗室温孵育30分钟／DAKO anti-goat immunoglobulins/HRP二抗室温孵育,DAB显色,苏木精复染后,1%盐酸酒精分化,脱水,透明,中性树胶封片。6.免疫组化结果判定方法同前7.免疫印迹实验(Western blotting)组织研磨,细胞裂解,匀浆,超声下震荡,煮沸,蛋白浓度均调制4%。配制分离胶及浓缩胶,灌胶。上样,电泳,PVDF膜,一抗孵育,脱脂奶粉封闭,二抗孵育,显示结果。凝胶图像分析系统拍照分析目的条带的灰度值。8.统计分析用SPSS 13.0软件进行数据分析。计量资料结果以均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用两样本t检验,两组间均数相关分析采用Pearson相关分析。计数资料两组间比较采用Mann-Whitney Test,p<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.模型组大鼠的体重显著小于正常对照组(t=3.035, P=0.004)。模型组大鼠的卵巢质量与对照组相比较无统计学差异(t=0.144, P=0.887)。去除大鼠体重的影响后,卵巢相对质量(mg／100g体重)在模型组与对照组间无显著性差异(t=1.171, P=0.249),模型组的卵巢相对质量略大于正常对照组。2.模型组卵巢形态学改变模型组大鼠卵巢可见较多早期发育的小卵泡和闭锁卵泡,皮质内黄体少见；囊状扩张卵泡明显增加,囊性卵泡内卵母细胞或放射冠消失,颗粒细胞层数减少,一些大的囊状卵泡颗粒细胞几乎完全缺失；卵泡膜增厚,间质细胞明显增生。3.模型组和对照组血清性激素水平的比较模型组大鼠血清T(t=5.449,P=0.000)、LH (t=4.922, P=0.000)和FSH (t=5.246, P=0.000)浓度显著高于对照组(P均<0.05),血清E2 (t=3.132, P=0.003)、P (t=7.796, P=0.000)水平较对照组显著降低。4.荧光定量PCR检测两组卵巢组织中FSHR.GATA-4和CYP19 mRNA表达1)模型组FSHR (t=4.496, P=0.000)、GATA-4 (t=6.515, P=0.000)和CYP19 (t=7.964,P=0.000) mRNA表达较正常对照组均显著增加,差异具有统计学意义。2) FSHR、GATA-4和CYP19 mRNA表达相关性Pearson相关分析显示：FSHR与GATA-4mRNA表达的相关系数r=0.705,P=0.000,两者存在显著正相关关系；GATA-4与CYP19 mRNA表达的相关系数r=0.733,P=0.000,两者也存在显著正相关关系。5.免疫组织化学方法检测1) CYP19蛋白在卵巢组织中的表达及定位CYP19蛋白表达的阳性信号定位于颗粒细胞浆内。在早期卵泡,模型组20只大鼠中有4只(++)、16只(+++),而对照组20只中有12(++)、8只(+++),经统计学分析模型组卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达较对照组的升高,差异具有显著性(P=0.011)；在晚期卵泡,模型组20只大鼠中有1只(－)、19只(+++),而对照组20只中有1只(+)、1只(++)、18只(+++),经统计学分析模型组卵泡颗粒细胞CYP19蛋白表达较对照组的略有升高,但差异不具有显著性(P=0.594)。2) GATA-4蛋白在卵巢组织中的表达及定位GATA-4蛋白表达的阳性信号主要定位于卵泡颗粒细胞核。在早期卵泡,模型组20只大鼠中有1只(－)、1只(+)、3只(++)、15只(+++),而对照组20只中有2只(－)、4只(+)、9只(++)、5只(+++),经统计学分析模型组卵泡颗粒细胞GATA-4蛋白表达较对照组的升高,差异具有显著性(P=0.004)；在晚期卵泡,模型组20只大鼠中有2只(－)、1只(++)、17只(+++),而对照组20只中有2只(++)、18只(+++),经统计学分析对照组的GATA-4蛋白表达较模型组的升高,但无显著性差异(P=0.572)。在晚期卵泡的膜细胞中也可见GATA-4蛋白表达。3) FSHR蛋白在卵巢组织中的表达及定位FSHR的表达产物主要定位于卵泡颗粒细胞浆内和胞膜。在早期卵泡,模型组20只大鼠中有1只(++)、19只(+++),而对照组20只中有1只(－)、5只(++)、14只(+++),经统计学分析模型组卵泡颗粒细胞FSHR蛋白表达较对照组升高,差异具有显著性(P=0.038)；在晚期卵泡,模型组20只大鼠中有7只(++)、13只(+++),而对照组20只中有8只(++)、12只(+++),经统计学分析两组FSHR蛋白表达无显著性差异(P=0.747)。6.免疫印迹实验(Western blotting)1)模型组卵巢组织中的FSHR(t=9.172,P=0.000)、GATA-4 (t=9.258,P=0.000)和CYP19 (t=8.227, P=0.000)蛋白的表达水平较正常对照组显著升高。2) FSHR、GATA-4和CYP19蛋白表达相关性Pearson相关分析显示：FSHR与GATA-4蛋白表达的相关系数r=0.707,P=0.000,两者存在显著正相关关系。GATA-4与CYP19蛋白表达的相关系数r=0.710, P=0.000,两者也存在显著正相关关系。小结：1.模型组卵巢组织中CYP19基因及蛋白的表达水平较正常对照组显著增加。CYP19蛋白在模型中的表达结果与本实验的第一部分检测PCOS患者中的表达结果相符,进一步提示CYP19参与了早期卵泡的生长发育过程,CYP19的过高表达与PCOS的发生密切相关。2.模型组卵巢组织中GATA-4基因及蛋白的表达水平较正常对照组显著增加。GATA-4蛋白在模型中的表达结果与本实验的第一部分检测PCOS患者中的表达结果相符,进一步提示GATA-4基因参与了早期卵泡的生长发育过程,GATA-4基因表达异常增高与PCOS的发生密切相关。3.模型组卵巢组织中FSHR基因及蛋白的表达水平较正常对照组显著增加。模型组颗粒细胞FSHR蛋白表达较对照组的升高,差异具有显著性,该结果与与本实验的第一部分检测PCOS患者的FSHR蛋白表达的结果不相符。考虑可能与模型组血清FSH水平较对照组明显升高有关。4. Pearson相关分析显示：FSHR与GATA-4蛋白和基因表达存在显著正相关关系,GATA-4与CYP19蛋白和基因表达两者也存在显著正相关关系。提示PCOS中CYP19表达的增高可能是由GATA-4的表达增高促使的。5.来曲唑诱导的SD大鼠出现与PCOS患者相似的卵巢病理改变及雄激素和黄体生成素水平升高等内分泌变化,同时颗粒细胞CYP19和GATA-4蛋白表达与本实验第一部分PCOS患者中的结果相符,提示该模型是一种较为理想的PCOS动物模型。全文小结1. PCOS患者早期卵泡颗粒细胞CYP19和GATA-4蛋白表达均较对照组显著性升高；在晚期卵泡,两组颗粒细胞CYP19和GATA-4蛋白表达无显著性差异。提示CYP19和GATA-4参与了早期卵泡的生长发育,两者在早期卵泡颗粒细胞中的过高表达与PCOS的发病有关。而PCOS组的早、晚期卵泡颗粒细胞FSHR蛋白表达与对照组比较无显著性差异。提示PCOS患者早期卵泡颗粒细胞GATA-4和CYP19的表达升高可能是由FSH以外的其它因素所介导的。2.动物模型中,早期卵泡颗粒细胞CYP19和GATA-4表达结果与PCOS患者表达的结果相一致。进一步提示CYP19和GATA-4参与了早期卵泡的生长发育,它们的过高表达与PCOS的发生密切相关。3.在动物模型中,利用Realtime-PCR和Western blotting法检测CYP19和GATA-4基因和蛋白在卵巢组织中的表达,证实PCOS卵巢组织中CYP19和GATA-4表达增高,提示CYP19和GATA-4的表达增高与多囊卵巢的发生有关。4.本研究首次发现PCOS中CYP19与GATA-4表达存在显著正相关关系,提示PCOS中CYP19的表达升高可能是由GATA-4表达增高所促使的。5.利用来曲唑成功诱导SD大鼠出现与PCOS患者相似的卵巢病理改变及雄激素和黄体生成素水平升高等内分泌变化,并且动物模型和PCOS患者卵巢中CYP19和GATA-4的表达结果一致,提示该模型是一种较为理想的PCOS动物模型。