目的：通过诱导肿瘤休眠的发生,使患者长期带瘤生存,正成为肿瘤治疗的新策略和新热点。抑制肿瘤血管生成和调节免疫能有效诱导肿瘤细胞的休眠。既往研究发现,以益气化瘀散结为治则的健脾化瘀方体内外实验均显示出较好的抗肿瘤效应。本研究通过实验模拟肿瘤患者进行手术,而术后体内仍存在少量肿瘤细胞休眠,但患者长期无症状体征,其后在一定条件下出现肿瘤复发转移的临床实际情况,建立小鼠肝癌休眠模型并验证休眠细胞的存在。通过健脾化瘀方进行干预,验证其促进和维持肿瘤细胞休眠的作用,并从抑制肿瘤血管生成和调节免疫角度,进一步探讨其促进肿瘤细胞休眠的可能机制及作用靶点,为其临床应用及进一步研究肿瘤休眠药物提供依据。方法：1研究一“建立小鼠肝癌休眠模型并验证休眠细胞的存在”在每只小鼠右侧腋下接种1×106个H22腹水型肝癌细胞,常规喂养2周,第15天选择表皮肿瘤直径大于0.5cm的小鼠,作姑息性手术(将肉眼可见肿瘤组织全部切除)。手术后的小鼠再常规喂养8周,如接种处未见肿瘤组织生长,即认为小鼠肝癌休眠模型建立成功(按照平均寿命折算,小鼠生存期8周,即相当于人类寿命5年)。其后将模型小鼠分为复发对照组和复发验证组,复发验证组给予连续外伤刺激,接种部位取材,组织固定和HE染色观察肿瘤再生成情况确定休眠细胞的存在。2研究二“健脾化瘀方对促进和维持肿瘤细胞休眠的作用及其可能机制”按上述方法建立小鼠肝癌休眠模型建立后,将60只肝癌休眠模型小鼠随机分为4组：正常对照组、化疗对照组、健脾化瘀方低剂量治疗组、健脾化瘀方高剂量治疗组,予截尾外伤刺激,同时分别给予干预措施,处死小鼠后,分别观察其肿瘤休眠情况、增殖指数、VEGF、TGF-β、IL-10表达等指标。结果：1研究一“建立小鼠肝癌休眠模型并验证休眠细胞的存在”1.1小鼠肝癌休眠模型的建立手术后30只小鼠全部存活,常规喂养8周后可观察到6只小鼠再次成瘤,其余24只小鼠未观察到肝癌细胞成瘤而考虑发生休眠,即有20%小鼠成瘤,80%处于休眠状态。1.2休眠肿瘤细胞的验证6周后,复发对照组12只小鼠仅1只肉眼可见接种处肿瘤重新生长,而复发验证组12只小鼠全部肉眼可见接种处肿瘤重新生长。处死所有24只模型小鼠,小鼠接种处石蜡组织染色切片均观察到存在的肿瘤细胞。提示在已发生肿瘤休眠的动物中,其体内休眠的肿瘤细胞经反复外伤刺激可再度激活,并发生重新生长增殖而导致肿瘤复发,同时进一步证明了休眠肿瘤细胞的存在。2研究二“健脾化瘀方对促进和维持肿瘤细胞休眠的作用及其可能机制”2.1健脾化瘀方干预后,空白对照组全部15只小鼠肉眼可见腋下接种处肿瘤重新生长,休眠率为0。而化疗对照组在第2、第3周共观察到有3只小鼠腋下接种处肿瘤重新生长,休眠率80.0%。中药低剂量组和高剂量组各有2只小鼠在第3周腋下接种处出现肿瘤包块,休眠率均为86.7%。此提示在肝癌休眠模型小鼠中,其体内休眠的肿瘤细胞经反复外伤刺激可再度激活,并发生重新增殖而导致肿瘤复发,而低剂量化疗、健脾化瘀方中药治疗均可促进和维持肿瘤细胞的休眠状态,化疗对照组、中药低剂量治疗组与高剂量治疗组促进和维持肿瘤细胞休眠状态的作用无明显差异。2.2健脾化瘀方干预后,空白对照组、化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组Ki-67增殖指数(PI)分别为41.68±2.09%,24.28±1.85%,19.58±0.61%和19.51±0.54%。化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组Ki-67增殖指数(PI)都低于空白对照组,差异均有显著性(P<0.05)；中药低剂量治疗组及高剂量治疗组分别与化疗对照组比较,Ki-67增殖指数(PI)都低于后者,差异均有显著性(P<0.05)；中药低剂量治疗组及高剂量治疗组比较差异无显著性(P>0.05)。此说明,化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均能抑制肿瘤细胞增殖,中药低剂量治疗组及高剂量治疗组抑制肿瘤细胞增殖能力强于化疗对照组,中药低剂量治疗组及高剂量治疗组之间抑制肿瘤细胞增殖作用差异不明显。2.3健脾化瘀方干预后,空白对照组、化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组VEGF表达阳性率分别为86.7%、40.0%、26.7%和26.7%。空白对照组VEGF表达水平明显高于化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组(P<0.05)但中药低剂量治疗组VEGF表达水平与化疗对照组比较无明显差异(P>0.05)；中药高剂量治疗组VEGF表达水平与化疗对照组比较无明显差异(P>0.05)。中药低剂量治疗组VEGF表达水平与中药高剂量治疗组比较也无明显差异(P>0.05)。说明化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均能抑制肿瘤细胞VEGF的合成与分泌,但三组之间两两比较,化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组抑制作用无明显差异。2.4健脾化瘀方干预后,空白对照组、化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组TGF-β表达阳性率分别为93.3%、53.3%、46.7%和46.7%。空白对照组TGF-β表达水平明显高于化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组(P<0.05)；但中药低剂量治疗组TGF-β表达水平与化疗对照组比较无明显差异(P>0.05)；中药高剂量治疗组TGF-β表达水平与化疗对照组比较无明显差异(P>0.05)。中药低剂量治疗组TGF-β表达水平与中药高剂量治疗组比较也无明显差异(P>0.05)。说明化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均能抑制肿瘤细胞TGF-β的表达,但三组之间两两比较,化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组抑制作用无明显差异。2.5健脾化瘀方干预后,空白对照组、化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组IL-10表达阳性率分别为93.3%、53.3%、46.7%和46.7%。空白对照组IL-10表达水平明显高于化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组(P<0.05)；但中药低剂量治疗组及中药高剂量治疗组IL-10表达水平分别与化疗对照组比较无明显差异(P>0.05)。中药低剂量治疗组IL-10表达水平与中药高剂量治疗组比较也无明显差异(P>0.05)。说明化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组均能抑制肿瘤细胞IL-10的表达,但三组之间两两比较,化疗对照组、中药低剂量治疗组及高剂量治疗组抑制作用无明显差异。结论：本方法成功建立了小鼠肝癌休眠模型,并通过外伤刺激,诱导肝癌休眠细胞重新生长增殖,从而验证休眠肿瘤细胞在体内的存在。而健脾化瘀方具有促进和维持肿瘤细胞休眠的作用,其作用机制可能与抑制肿瘤血管生成和调节免疫有关。