研究背景及目的乳腺癌严重威胁女性健康,传统的治疗方法有手术、化疗和放疗等,但治疗后仍然有部分患者出现术后胸壁复发,生存期缩短的现象。光动力疗法(Photodynamic Therapy,PDT)以其安全、有效、特异性强等优点脱颖而出,现已成为治疗乳腺癌,尤其是保乳治疗中非常有效的方法。光敏剂、组织氧和光是PDT成功实施的主3个成分,其中光敏剂是核心。光敏剂的开发与应用推动着PDT的发展,研发光敏活性强、暗毒性低、肿瘤靶向性高的新型光敏剂是进一步推进PDT临床应用、拓宽其适用范围的关键性问题。随着研究深入和技术的进步,光敏剂的发展经历了三代,其中第二代光敏剂在光动力治疗中显示出明显优势。第二代光敏剂主要包括:卟啉衍生物、酞菁类、卟吩类、其它类型光敏剂。卟吩类由于单线态氧产量高,理想的作用光谱等特点成为近年来国内外研究治癌新药的重点对象之一。HPPH为二氢卟吩类化合物,因具有良好的光动力活性,临床用于膀胱癌、食管癌、胃癌等多种实体肿瘤的治疗。NPe6是另一种批准用于临床PDT治疗的二氢卟吩类光敏剂,目前正在进行皮肤癌的Ⅱ期临床试验阶段。m-THPC的光敏活性比第一代光敏HpD高出两个数量级,主要用于头颈肿瘤、食管癌以及复发乳腺癌等的治疗。二氢卟吩类光敏剂的光敏活性和PDT治疗肿瘤的效果已被广泛认可,但是还存在一些缺陷例如HPPH完全不溶于水;NPe6或m-THPC介导的光动力疗法在治疗过程中会造成皮肤光毒性、迟发的神经痛等副作用,而且价格昂贵,所以这些光敏剂很难在临床中广泛应用。左卟吩钠(S-Porphinsodium,S-PS)是二氢卟吩类化合物,成分单一,纯度高达99.5%,在600-700 nm范围内有一个有强吸收峰,是一种完全水溶的新型光敏剂。我国拥有自主知识产权,质量可控,可产业化生产。S-PS和HPPH制备的起始原料相同,且具有相同的大环结构,还解决了人体对这类光敏剂不易吸收的缺点。前期研究显示S-PS-PDT能显著杀伤胆管癌细胞,且联合VEGF后杀伤效果更显著。S-PS作为一种新型光敏剂,目前尚处前期探索研究阶段,其介导的光动力疗法对乳腺癌杀伤效应研究未见报道。因此,本课题拟对S-PS的理化性质进行分析,并从细胞实验、BSA损伤和动物实验三个方面对S-PS-PDT对乳腺癌的杀伤效应及抗肿瘤机制进行探究,以期为S-PS用于乳腺癌的临床治疗提供依据。研究方法及结果第一部分S-PS的理化性质分析实验主要采用紫外-可见分光光度计及荧光分光光度计对S-PS理化性质进行检测。实验结果表明:在300-700 nm范围内,S-PS吸收光谱有4个明显吸收峰,最强峰位于398 nm左右处。在600-700 nm范围内,荧光发射光谱有一个强发射峰,峰位在650 nm左右处;S-PS吸收值随着光照强度的增强而逐渐降低;其单线态氧产景随着光照剂量增加而增加。在相同处理条件下,S-PS的单线态氧产量低于HPPH,但是高于 Ce6、HMME、HP、PpIX。第二部分S-PS-PDT对MDA-MB-231和4T1细胞的杀伤效应研究实验主要通过MTT法,流式细胞术分析,MTG染色结合激光共聚焦显微镜研究了 S-PS在乳腺癌细胞中的富集特性,S-PS-PDT对细胞的毒效应、细胞膜及DNA损伤程度、ROS生成情况,以及S-PS的亚细胞定位。研究发现:在48 h内MDA-MB-231和4T1细胞对S-PS吸收逐渐增加;在0-10 μg/mL浓度范围,单纯的S-PS对MDA-MB-231和4T1细胞都没有暗毒性。S-PS-PDT能够显著抑制MDA-MB-231和4T1细胞的增殖;流式细胞仪检测发现S-PS-PDT可以诱导MDA-MB-231和4T1细胞发生凋亡,DNA呈现出片段化,细胞膜通透性增加;MDA-MB-231和4T1细胞经S-PS-PDT处理后ROS水平显著升高,激光共聚焦显微镜观察发现S-PS主要定位在MDA-MB-231和4T1细胞的线粒体中,提示线粒体是S-PS-PDT损伤的重要靶点。第三部分S-PS-PDT对BSA损伤效应研究实验采用吸收光谱及荧光光谱变化来评价S-PS-PDT对BSA的损伤。结果显示:S-PS和S-PS-PDT分别能使BSA产生增色效应及荧光猝灭现象。单独的S-PS和S-PS-PDT都能降低BSA分子中色氨酸和酪氨酸残基的荧光,且色氨酸残基荧光下降趋势明显高于较酪氨酸残基。以上结果表明S-PS-PDT可以损伤蛋白质结构,而且S-PS与BSA上色氨酸残基作用距离较酪氨酸残基近。推测蛋白质可能是S-PS-PDT损伤的靶点之一。第四部分S-PS在4T1荷瘤小鼠体内的代谢研究利用荧光分光光度计测定S-PS在4T1荷瘤小鼠肿瘤及心、皮肤、肺、脾、肌肉、肝、肾内的代谢变化,对确定后期实验中小鼠尾静脉给药后的光照处理时间具有重要意义。结果显示:S-PS经尾静脉注射后4 h,其在移植瘤内的浓度达到最大值;6 h(89.80%)荧光强度与4 h没有显著性差异,8 h(74.51%)后急剧下降;其他主要脏器内光敏剂浓度在注射6 h后均达到较低水平,在给药24 h后S-PS在各组织内基本代谢完毕。说明S-PS在荷瘤小鼠体内代谢速度快,可有效的减轻对正常组织的副作用。从安全性和治疗效果两方面考虑6 h可作为药物注射后光照处理时间点。第五部分S-PS-PDT对4T1移植瘤的杀伤作用探究建立4T1移植瘤小鼠模型,探究S-PS介导的多次PDT疗法对移植瘤的杀伤效应。通过谷丙转氨酶、谷草转氨酶和尿素氮检测及主要脏器HE染色观察对处理模式进行安全性评价。研究结果显示:S-PS介导的多次PDT疗法能显著抑制4T1移植瘤的生长,同等处理条件下,S-PS和HPPH有相似的抑瘤效果;S-PS-PDT能有效抑制肿瘤生长且显著延长小鼠存活期,且此种处理方式具有较高的安全性。结论综上所述,本课题对S-PS的理化性质进行了研究,从S-PS-PDT对MDA-MB-231和4T1细胞的杀伤效应、BSA损伤效应、4T1荷瘤小鼠体内的代谢、4T1移植瘤的杀伤作用这几个方面证实了 S-PS是一种有潜力的新型光敏剂,且处理模式安全有效,研究结果能为推动S-PS的临床应用提供重要的理论依据。