腺病毒介导的HCMV UL49基因小鼠模型的建立

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目的:建立表达人巨细胞病毒UL49基因的小鼠模型,为筛选以人巨细胞病毒UL49基因为靶的抗病毒药物奠定基础。方法:(1)构建重组腺病毒穿梭质粒pDC316-UL49-GFP和阳性对照pDC316-GFP,分别通过脂质体与腺病毒骨架质粒pBHGloxdeltaE1,3Cre共转染293细胞,经位点特异性重组获得重组腺病毒Ad-UL49-GFP和Ad-GFP,并通过PCR鉴定Ad-UL49-GFP和Ad-GFP,再经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒感染液。(2)同一代小鼠经尾静脉注射腺病毒,饲养7天,取小鼠心、肝、脾、肺、肾各组织提取RNA和人巨细胞病毒UL49基因表达蛋白。(3)用荧光定量PCR和Western blot方法,检测转基因小鼠心、肝、脾、肺、肾各组织中UL49基因mRNA和蛋白的表达水平。结果:(1)成功构建腺病毒穿梭质粒pDC316-UL49-GFP和pDC316-GFP,与pBHGloxdeltaE1,3Cre共转染293细胞获得了重组腺病毒Ad-UL49-GFP和Ad-GFP. Ad-UL49-GFP和Ad-GFP经扩增、纯化后,病毒滴度分别为7.9×108pfu/ml和1.58×109pfu/ml。(2) Ad-UL49-GFP及Ad-GFP通过尾静脉分别注射小鼠7天后,在心、肝、脾、肺、肾组织中,荧光定量PCR分别检测到UL49-GFP及GFPmRNA的表达,Western blot分别检测到UL49-GFP蛋白及GFP蛋白的表达,其中肝、心、脾、肾中表达量相对较高,肺中表达量相对较低。结论:成功构建携带人巨细胞病毒UL49基因的复制缺陷型重组腺病毒Ad-UL49-GFP及阳性对照Ad-GFP,经大量扩增和纯化获得高滴度病毒感染液,并在小鼠体内得到表达,该转基因小鼠可作为筛选以人巨细胞病毒UL49基因为靶的抗病毒药物的动物模型。
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