天然橡胶是一种重要的战略物资,主要来源是巴西橡胶树Hevea brasiliensis。炭疽病是巴西橡胶树的一种重要叶部病害,危害严重时会引起橡胶树落叶,影响天然橡胶产量。橡胶树炭疽病病原种类多样,其中Colletotrichum siamense是我国橡胶树田间主要病原种类。前期研究显示炭疽菌的脂滴包被蛋白CsCap20影响菌体脂滴的形成,并影响了附着胞的膨压和致病性。本研究通过酵母双杂技术从炭疽菌cDNA文库中筛选CsCap20的候选互作蛋白,并通过Pull down和Co-IP(Co-Immunoprecipitation)技术进行验证;同时采用基因敲除技术,对筛选获得的候选互作蛋白疏水蛋白CsHydr进行了功能分析。本研究初步了解了脂滴包被蛋白CsCap20互作蛋白成员和疏水蛋白CsHydr的功能。为进一步研究脂滴包被蛋白的调控和深入了解炭疽菌的致病机制奠定基础。主要研究结果如下:1、对炭疽菌脂滴包被蛋白CsCap20互作蛋白的筛选和鉴定(1)以CsCap20为诱饵蛋白,利用酵母双杂交从橡胶树炭疽菌cDNA酵母文库中筛选获得阳性克隆有16个。经分析显示,它们分别为腺苷酸环化酶依赖性蛋白激酶A催化亚基、蛋白激酶、乙酸激酶、铁还原酶样跨膜成分蛋白、组氨酸酸性磷酸酶、疏水蛋白、翻译起始因子、糖蛋白、磷酸盐:H~+同向转运蛋白、包含bys1结构域的蛋白以及6个假定蛋白。(2)克隆获得乙酸激酶编码基因全长。结果显示:乙酸激酶CsAck基因包含一个内含子,DNA为1313bp,cDNA为1248bp,编码415个氨基酸,含有乙酸激酶结构域,编码基因命名为CsAck。(3)利用Pull down技术证实了CsCap20能和CsAck发生体外互作。利用Co-IP技术证实了橡胶树炭疽菌脂滴包被蛋白CsCap20与蛋白激酶A的催化亚基CsPKA-C1和乙酸激酶CsAck存在体内互作关系。2、橡胶树炭疽菌疏水蛋白CsHydr的功能鉴定(1)克隆了疏水蛋白CsHydr的基因(登录号:MN166623),该基因包含2个内含子,DNA全长520 bp,cDNA为417 bp,编码138个氨基酸,在蛋白的N端含有由19个氨基酸组成的一段信号肽,具有疏水结构域HYDRO。构建了含信号肽的PET-32a-CsHydr和缺失信号肽的PET-32a-CsHydr-18aa融合表达载体,经验证,去除信号肽的表达载体能在大肠杆菌中成功表达出疏水蛋白,而保留信号肽的原核表达载体不能表达出该蛋白。表明信号肽的存在会影响疏水蛋白的原核表达。(2)利用同源重组法获得基因敲除突变体ΔCsHydr-66,观察表型。结果显示:与野生型相比,突变体ΔCsHydr-66在PDA培养基上菌落直径略大;分生孢子极显著缩小,长度缩短18%,宽度缩短12%;菌丝表面疏水性降低;突变体对刚果红的敏感性显著高于野生型;基因缺失突变体的致病能力降低。研究结果表明疏水蛋白CsHydr参与了炭疽菌分生孢子形态建成、菌丝表面疏水性、细胞壁完整性和致病性功能。但疏水蛋白和脂滴包被蛋白互作还需要进一步验证,二者的互作生物学功能还需深入开展研究。