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造血分化是人体中最重要的生命活动之一,整个分化过程是由多个调控因子及信号通路协同调控所完成的,涉及到许多复杂的生物学过程。造血分化起始于造血干细胞,经红系爆炸形成单位(BFU-E)、红系集落形成单位(CFU-E)、网织红细胞等多个阶段,最终脱核形成成熟的红细胞。PDCD2是Programmed Cell Death基因家族中的一员,PDCD2及其同源基因Zfrp8被发现在调控肿瘤发生发展以及正常细胞的增殖、分化等一系列生理及病理过程中具有重要的作用。 已有较多研究发现,PDCD2与细胞程序性死亡并没有直接关系。在果蝇及斑马鱼中发现,PDCD2可参与调控淋巴及造血的分化发育,但PDCD2在人类细胞中的相关研究却报道较少。因此探究PDCD2在人类造血细胞中的功能及作用机制可以更加清晰的揭示该因子的作用,同时为深入理解造血分化的机制提供新的理论依据。本研究通过构建稳定敲低PDCD2的细胞系来研究其在红系细胞系模型中的功能及作用机制。发现,在红系分化细胞模型TF-1细胞中可显著敲低PDCD2的mRNA及蛋白水平。而且在TF-1细胞中敲低PDCD2的表达能够促进珠蛋白、红系特异转录因子的表达。同时,在诱导细胞向红系方向分化过程中,红系细胞表面特征性分子marker CD235a和CD71双阳性细胞占细胞总量的比例显著上升。 在明确了PDCD2对红系分化的调控功能后,提取了稳定敲低PDCD2的TF-1细胞的RNA,经测序获得了实验组与对照组的转录组信息。通过对差异表达基因的分析发现,PDCD2缺陷会影响多个造血作用相关基因的表达。差异表达基因高度富集到了造血系统的发育及功能实现、造血发生、组织发育等几大功能模块中;同时更细致的信号通路分析发现,PDCD2的敲低会显著抑制T细胞、B细胞、DC细胞等免疫细胞分化相关的信号通路活性。而针对差异表达基因在染色体上的位置分析,发现CHR6P22上存在有大量编码组蛋白变异体的基因被高度富集且普遍过表达。通过对富集的组蛋白基因启动子区域可能结合的转录因子预测发现,存在有Pol2、YY1等可与这些组蛋白启动子结合的转录因子也在PDCD2缺失的细胞中高表达。通过Chip-qPCR实验,发现PDCD2的缺失会造成红系特异基因启动子区组蛋白H3乙酰化水平明显上升。这提示PDCD2可能通过影响细胞内组蛋白变异体的表达从而改变红系特异基因的表观水平,进而促进其表达。而PDCD2的缺失又会显著影响细胞内核糖体蛋白在细胞中的定位及表达水平。综合我们的实验及差异基因分析结果,初步推测PDCD2与造血及淋巴细胞分化发育密切相关,PDCD2缺失一方面会显著抑制细胞向淋巴系分化,同时又会促进珠蛋白、GATA1、HBA、HBB等红系特异的基因表达,从而参与红系分化的调控过程。 综上,本课题通过多种实验手段探究并结合相关文献阅读,在人类红系细胞模型中明确了具有造血调控作用和功能的因子PDCD2。之后借助转录组测序技术,对PDCD2可能的调控机制进行了分析,并结合实验结果对其可能的分子机制进行了初步的假设。这些工作丰富了造血分化调控网络的基础理论研究,为造血作用相关的分化发育机制的进一步阐明提供了重要线索,同时也为PDCD2在造血分化中的作用提出了新的见解。