在以往的研究中发现微重力对动物细胞的生理状态具有显著的影响,但以往的研究偏重于微重力对于各项生理指标的影响,对于具体的分子机制研究较少。众所周知,细胞内的信号通路较为复杂,而mTOR(mammalian target of rapamycin即雷帕霉素在哺乳动物细胞中作用的标靶)信号通路上游承接其它信号通路,下游直接涉及蛋白质合成、细胞凋亡、细胞自噬等造成细胞生理状态改变的反应,因此mTOR信号通路可以作为一个突破口,研究某一种信号通路对细胞生理状态的影响,继而以之为起点推广到整个信号通路网络。同时在课题组以往的研究中发现,模拟微重力对mTOR分子活性有一定的影响。由此,本工作建立模拟微重力模型与药物控制模型,以探究mTOR通路上的不同分子活性对细胞在形态与粘附性、增殖、迁移、凋亡四个方面的影响。通过探究mTOR信号通路变化情况,阐明模拟微重力影响细胞生理状态的分子机制。以BL6-10黑色素瘤细胞为研究对象,运用三维双轴回转仪建立模拟微重力模型,使用mTOR抑制剂雷帕霉素(rapamycin)与可以上调mTOR活性的CNF1(Cytotoxic Necrotizing Factor 1即细胞毒素1)建立药物控制模型。运用免疫荧光染色法通过对微丝(Microfilaments)、微管(Tubulin)、粘着斑(Vinculin)、肌动蛋白(Actin)的染色观察微重力和两种药物对细胞形态与粘附性的改变情况,运用蛋白免疫印迹技术检测细胞骨架与粘附性相关蛋白α-tubulin、β-tubulin、FAK、vincullin、Rho A、SUN2等表达情况。通过测定不同时间点的细胞数量来确定细胞生长的改变,运用MTS技术探究细胞的增殖情况,并运用流式细胞术检测两种模型下细胞周期的阻滞情况。通过体外与体内的迁移实验探究肿瘤细胞迁移能力的改变。运用蛋白免疫印迹技术对细胞周期蛋白Cyclin B1与迁移标志分子CD44、Met、p-Met进行定量分析。运用流式细胞术对两种模型的凋亡情况进行检测,运用免疫荧光染色法观察细胞核物质与细胞核骨架变化情况。运用蛋白免疫印迹技术检测凋亡信号通路与DNA修复通路相关蛋白的表达变化情况。最后运用蛋白免疫印迹技术检测mTOR信号通路相关分子的表达变化情况,并与上述现象建立关联。结果显示,相较于正常重力组,在模拟微重力和mTOR抑制剂雷帕霉素处理下,细胞形态均发生了改变,微丝、微管、肌动蛋白的分布异常;粘着斑的分布发生一定的紊乱。模拟微重力所造成的改变在CNF1的处理有一定的恢复。某些细胞骨架蛋白与粘附蛋白的表达产生适应现象。在模拟微重力和雷帕霉素处理下细胞增殖速率变慢,CNF1可以部分恢复模拟微重力下的这种效应,但是未能恢复到正常重力组水平。模拟微重力组与雷帕霉素处理组均出现了细胞周期阻滞的情况,但是阻滞的时期并不相同,CNF1处理组未能完全修复模拟微重力造成的细胞周期阻滞。肿瘤细胞的迁移能力在模拟微重力和mTOR抑制剂处理后均有所下降,CNF1处理后有一定恢复。一部分与转移相关的分子表达量在模拟微重力和雷帕霉素作用时发生下调,但某些分子产生适应现象。同样,模拟微重力与mTOR抑制剂雷帕霉素均会导致细胞核骨架的紊乱,促进黑色素瘤细胞的凋亡,核骨架蛋白的表达下降。以上结果表明,模拟微重力造成mTOR分子的下调,影响其下游分子的表达,抑制了相关蛋白质的合成,导致细胞骨架、粘着斑和核骨架的分布紊乱,细胞形态与粘附性的下降,同时激活了凋亡相关信号通路分子表达,促进了凋亡的发生。其表现与mTOR活性被抑制导致的表现相一致。证明mTOR信号通路在微重力对细胞的影响中有重要作用。