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目的:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA,cccDNA)是乙肝病毒前基因组RNA(Pregenomic RNA,pg RNA)复制的原始模板,对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。以往文献报告了多种进行HBV cccDNA定量检测的方法,各有其利弊。本研究拟采用荧光定量聚合酶链反应即荧光定量PCR(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)的检测方法进行HBV cccDNA定量检测,初步探讨HBV cccDNA荧光定量检测方法在慢性乙型肝炎患者肝组织中的临床应用及意义。方法:通过使用HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA的特异性引物和探针,将含有HBV基因的p HBV1.3-B6质粒作为标准品,根据HBV质粒的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA、BV Total DNA以及HBV pg RNA含量;用Jukart细胞DNA作为检测管家基因β-actin的标准品,根据人类基因组DNA(Human genomicDNA,hg DNA)的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测β-actin基因含量,计算肝细胞数,并对每个肝细胞内含有的HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA进行标准化;并在He PGAD38细胞和THP-1细胞中验证该方法。检测HBV感染患者肝组织HBV cccDNA定量,包括终末期肝病患者(包括肝硬化和肝癌)11例和核苷酸类似物(Nucleos(t)ide analogs,NAs)经治的慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者5例(于基线和继续NAs治疗48周时肝穿刺活检取样)。通过检测患者肝组织的相关病毒学指标,分析肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量在临床实践中的意义。结果:1.在He PGAD38细胞中成功检测到HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA,其含量分别为3.89 copies/cell(IQR 3.44-4.49)、1289.43 copies/cell(IQR859.96-6038.50)、6.42 copies/cell(IQR 5.06-7.85),而阴性对照的THP-1细胞未能检查到相关指标。2.HBe Ag阴性的终末期肝病患者中,未经抗病毒治疗的患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平显著高于已接受抗病毒治疗的患者(分别为P<0.0001,P=0.0004);在HBe Ag阴性的核苷类似物经治的终末期肝病患者中,血清HBV DNA阳性的患者肝细胞HBV cccDNA水平明显高于血清HBV DNA转阴的患者(P=0.0238),而肝细胞HBV Total DNA定量水平两组无显著性差异(P>0.05)。3.本研究3例HBe Ag阳性核苷经治患者基线时肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.93 copies/cell、1.62 copies/cell、0.05 copies/cell(均取中位数);2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.05 copies/cell、0.38 copies/cell、0.01 copies/cell(均取中位数)。HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA含量均高于HBe Ag阴性患者,两组比较没有统计学差异(P>0.05)。继续NAs抗病毒治疗48周后肝组织检测,3例HBe Ag阳性肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量的中位数分别为0.31 copies/cell、0.22 copies/cell、0.06 copies/cell;2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA的含量分别为0.05copies/cell、0.22 copies/cell、0.00 copies/cell。治疗48周后,HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA含量均较基线时降低(无统计学差异,P>0.05)。HBe Ag阴性患者HBV Total DNA和HBV pg RNA定量中位数在48周较基线时有所下降(无统计学差异),但HBV cccDNA定量无变化。结论:成功建立了慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测的荧光定量PCR方法。抗病毒治疗可显著降低HBe Ag阴性的终末期肝病患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平。肝细胞HBV cccDNA定量是可用于评价临床慢乙肝患者抗病毒疗效较为精确可靠的指标之一,本研究不足之处在于样本量较小,需要进一步扩大样本研究。