目的:化疗耐药性是肝细胞癌治疗过程中的一大障碍。NRF2-ARE信号通路能够调节机体氧化还原稳态，参与肿瘤预防，是细胞对抗氧化损伤和药物毒性的最重要防御机制。尽管提高NRF2-ARE活性具有抗氧化并增强细胞解毒能力的作用，但越来越多的研究表明，NRF2的持续和过度活化与多种癌症的发生、发展和耐药密切相关。肿瘤细胞中活化的NRF2通过调控一系列信号通路可发挥自我保护的作用:通过结合ARE启动下游抗炎、抗氧化、Ⅱ相解毒酶等基因的表达为肿瘤细胞提供适于生长的环境;通过调控EGFR-MEK1/2-ERK通路促进肿瘤细胞增殖;通过调控VEFG的表达促进肿瘤细胞转移;通过激活抗凋亡基因BCL-2与BCL-XL，使肿瘤细胞保持长寿状态;通过调控药物转运蛋白将化疗药物由肿瘤细胞内泵至细胞外，从而降低化疗药物在肿瘤细胞内的有效蓄积，使肿瘤细胞产生化疗耐药性。鉴于NRF2在促进肝癌细胞增殖、转移及化疗耐药性中的重要作用，寻求有效的NRF2抑制剂，通过特异性抑制NRF2的活化，进而提高肝癌的化疗敏感性可为肝癌的临床治疗提供新的靶点。本课题组通过ARE-荧光素酶报告系统筛选出可在较低剂量（0.1μM）起到抑制ARE转录活性的新型NRF2-ARE抑制剂---喜树碱(CPT)，一种从植物喜树中提取的，目前临床上用于治疗头颈部及消化道肿瘤的化疗药物。本课题拟探究NRF2在肝癌组织中的表达水平及其活性与肿瘤进展及预后的关系;NRF2在介导肝细胞癌化疗耐药性中的作用;进一步在肝癌细胞中研究CPT抑制NRF2-ARE活性的机制以及与化疗药物联合应用检测其在提高肝细胞癌化疗敏感性中的作用，以期为肝癌的临床治疗提供新的用药指导。　　研究方法:本研究收集临床新鲜肝癌组织及相应癌旁组织标本，一部分制作石蜡切片对NRF2行免疫组化染色，另一部分提取蛋白及RNA行分子生物学检查，包括:NRF2-ARE信号通路中NRF2、NQO1、HO-1、KEAP1蛋白行Western blot检测，相关基因NRF2、GCLC、GCLM、NQO1、HMOX1、AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3行RT-qPCR检测，以期明确肝癌组织中NRF2的表达情况，并通过NRF2-ARE下游基因的表达水平计算得出肿瘤组织中相对NRF2评分;收集肝癌患者一般信息及肿瘤相关指标（肝炎病毒量、肿瘤大小、肿瘤数目、血清肿瘤标志物AFP，肝功能分级、巴塞罗那分期等），采用Spearman相关分析对肿瘤组织内相对NRF2评分与肿瘤相关性指标进行相关性分析，以探讨NRF2活性在评价肿瘤进展及预后中的作用;在人肝癌细胞HepG2中应用基因稳转沉默技术建立NRF2沉默和系统活化的细胞模型，并研究NRF2不同表达水平对肿瘤细胞化疗敏感性的影响，以探究NRF2在介导化疗耐药中的作用;在HepG2细胞中研究CPT对NRF2-ARE活性的影响，检测CPT处理后NRF2蛋白及ARE下游基因变化情况，并在肺癌细胞A549中进一步验证CPT对NRF2活化的抑制作用，以除外CPT作用的细胞特异性;在HepG2细胞中探究CPT对亮氨酸拉链家族另一成员NRF1活化的影响，以确证CPT是否为NRF2特异性抑制剂;进一步研究CPT对NRF2-ARE抑制作用的机理，CHX实验检测CPT对NRF2蛋白降解的影响，以探究CPT对NRF2-ARE抑制作用的作用环节;联合临床肝癌化疗药物（三氧化二砷、表阿霉素、氟脲嘧啶）处理肝癌细胞，采用MTS方法检测细胞活力、流式细胞技术检测细胞凋亡情况、RTCA系统检测细胞增殖情况，通过比较联合用药组与单纯化疗药组的细胞活力、凋亡、增殖情况的差异，阐明CPT在改善肝癌细胞化疗敏感性中的作用，并将CPT的化疗增敏作用在肺癌细胞中进行验证。　　结果:1.收集临床肝癌组织及相应癌旁组织标本各16例，其中，男13例，女3例，平均年龄53.56岁，病理结果提示10例中分化、4例低分化、2例中低分化肝细胞癌。NRF2蛋白免疫组化染色显示肝癌组织中NRF2的表达明显高于相应癌旁组织，且在肿瘤组织细胞核中有明显染色，Western blot结果显示肝细胞癌组织中NRF2蛋白表达水平显著高于相应的癌旁组织，且癌组织中增加的NRF2以高活性的低磷酸化型为主。癌组织中受NRF2调控的Ⅱ相解毒酶NQO1、抗炎类蛋白HO-1的表达水平也明显高于癌旁组织，而与NRF2有负调控作用的KEAP1则在癌组织及癌旁组织的表达无明显差异。RT-qPCR结果发现，肝癌组织中NRF2的mRNA水平显著高于癌旁组织(p＜0.05)，同时其下游Ⅱ相解毒酶基因NQO1、抗氧化基因(AKR1C2，AKR1C3)在癌组织中的转录水平高于癌旁组织(p＜0.05)，NRF2活性可由相对NRF2评分具体量化，相对NRF2评分是由ARE下游7个经典基因NQO1、GCLC、 GCLM、 HMOX-1、AKR1C1、AKR1C2、AKR1C3的mRNA表达水平经过校正相加得来的，结果显示癌组织中相对NRF2评分明显高于癌旁组织(p＜0.05)。Spearman方法分析相对NRF2评分与肿瘤相关指标的关系时得出，NRF2活化与血清甲胎蛋白水平成正相关，相关系数r=0.67，p＜0.05。2.体外实验中，应用人肝癌细胞株HepG2研究发现，NRF2稳转沉默显著增加了细胞对NaAsO2的敏感性，敏感性由高到低依次为:NRF2沉默组、对照组、NRF2活化组，由此表明NRF2-ARE是决定肝癌细胞对化疗敏感性的关键因素之一。无毒性剂量的CPT可在正常情况下及三氧化二砷(As2O3)激发的情况下显著抑制HepG2及A549细胞中NRF2-ARE活性，降低ARE依赖基因的mRNA水平，并呈明显的剂量-效应关系，且CPT的有效作用剂量低至的0.1μM。CPT抑制了NRF2 mRNA及蛋白水平，但对NRF1的活化则无明显抑制作用，CHX实验显示CPT对NRF2蛋白降解过程无明显影响，可将CPT作用环节进一步缩小。更为重要的是，CPT在联合化疗药物As2O3、表阿霉素、氟脲嘧啶、顺铂处理肿瘤细胞时，显著增加了化疗药物的细胞毒性，促进了肿瘤细胞的凋亡，抑制了肿瘤细胞的增殖，大大提高了肿瘤细胞对药物的化疗敏感性，且此作用具有NRF2依赖性的。　　结论:1.NRF2在肝细胞癌组织中处于高表达、高活性状态;　　2.高表达的NRF2是影响肝细胞癌化疗敏感性的主要因素之一;　　3.NRF2有望作为提高化疗敏感性的靶点;　　4.CPT为NRF2-ARE特异性抑制剂;　　5.CPT可有效抑制肝癌细胞基础和化疗过程中NRF2的活化，从而提高癌细胞对化疗药物的敏感性。