背景:肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种能够引起肺炎、脓毒症、尿路感染和软组织感染的革兰氏阴性菌,也是最常见的容易出现多重耐药和泛耐药的细菌。在生长过程中会遇到温度、pH值、氧化压力和渗透压等多种环境因素压力,细菌通过感应环境因素变化、调控自身基因表达而适应环境。同时一种环境因素变化所引起细菌基因表达的改变又可能会影响细菌对其它因素的敏感性。高盐渗透压环境可以被EnvZ-OmpR双组分系统感应并调控外膜蛋白表达进而影响肺炎克雷伯菌对抗生素的敏感性。除此双组分系统外,是否还有其它调控因素参与其中?目的:KbvR作为一个新发现的转录调控子,与肺炎克雷伯菌荚膜、生物膜形成及细菌致病力相关。本研究在此基础上分析KbvR在肺炎克雷伯菌高盐渗透压环境适应及抗生素敏感性中的作用与机制,从而更加深入地认识KbvR调控子功能。方法:体外通过改变LB培养基中NaCl的浓度（1%、1.5%、1.9%、2.5%、3.2%、4%）模拟不同渗透压环境,分析肺炎克雷伯菌在不同渗透压环境中存活率,了解渗透压环境对肺炎克雷伯菌生存的影响。利用荧光定量PCR（qRT-PCR）分析kbvR基因在正常生理渗透压（1%NaCl）及高盐渗透压（2.5%NaCl）环境表达水平的改变,明确kbvR基因表达是否受到渗透压改变的调控。构建kbvR基因缺失株（ΔkbvR）和回补株（C-kbvR）,通过渗透压环境生长实验和抗生素敏感性实验研究肺炎克雷伯菌WT和ΔkbvR菌株对不同渗透压环境和抗生素的抵抗力,明确KbvR在肺炎克雷伯菌渗透压抵抗及抗生素敏感性中的作用。利用qRT-PCR及蛋白电泳（SDS-PAGE）分别从基因转录水平及蛋白表达水平分析WT和ΔkbvR菌株之间外膜孔蛋白OmpK36表达差异,并在kbvR基因缺失株中导入pGEM-ompK36质粒构建OmpK36表达菌株ΔkbvR+ompK36。检测WT、ΔkbvR、ΔkbvR+ompK36菌株膜通透性改变及对β-内酰胺类抗生素的最小抑菌浓度（MIC）,分析KbvR调控外膜蛋白OmpK36表达与肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素敏感性的关系。分析不同渗透压作用后肺炎克雷伯菌WT与kbvR基因敲除株中OmpK36表达情况及对β-内酰胺类抗生素的敏感性,了解外界渗透压对肺炎克雷伯菌抗生素敏感性的影响及KbvR调控OmpK36表达在其中所起作用。利用DAP-seq技术全基因组寻找可能受到KbvR直接调控的基因并分析ompK36基因启动子区是否存在KbvR结合位点,表达纯化KbvR蛋白,微量热涌动（MST）实验验证KbvR对OmpK36调控机制。最后利用生物信息学分析kbvR基因启动子区可能结合的调控因子并利用MST实验验证,寻找KbvR上游调控因子。结果:肺炎克雷伯菌在含1.9%和2.5%NaCl培养基中细菌存活率较在1%NaCl的常规LB培养基（生理渗透压环境）环境中分别下降至60%和42%。在高盐渗透压环境（2.5%NaCl）中kbvR与omp R基因转录水平均升高。虽然1%NaCl LB培养基中肺炎克雷伯菌野生株WT与ΔkbvR菌株生长无区别,高盐渗透压环境（2.5%NaCl）中kbvR基因敲除株的存活率显著高于野生株（73.21%vs.43.03%,P＜0.05）,说明KbvR调控子与肺炎克雷伯菌高盐渗透压环境的适应相关。与WT相比,ΔkbvR菌株对头孢西丁、氯霉素和多粘菌素B的MIC值增加4倍,对头孢唑林的MIC值增加8倍。结果表明kbvR基因缺失后,肺炎克雷伯菌对渗透压环境及部分抗生素尤其β-内酰胺类抗生素敏感性降低。RNA-seq、qRT-PCR和SDS-PAGE结果显示ΔkbvR菌株中主要外膜孔蛋白OmpK36表达明显下调。当在ΔkbvR菌株中回补ompK36基因后（ΔkbvR+ompK36菌株）,OmpK36蛋白的表达量较ΔkbvR菌株有所上升。膜通透性实验表明ΔkbvR菌株外膜通透性较WT株降低而ΔkbvR+ompK36菌株膜通透性得以部分恢复。说明KbvR调控OmpK36表达能够影响肺炎克雷伯菌外膜通透性。与ΔkbvR相比,ΔkbvR+ompK36菌株对头孢西丁和头孢唑林的MIC值分别降低了2倍和8倍,其对抗生素的敏感性得到一定恢复,说明受到KbvR调控的外膜孔蛋白OmpK36表达影响细菌对抗生素的敏感性。高盐渗透压环境（2.5%NaCl）诱导肺炎克雷伯菌kbvR基因与ompK36基因表达。在kbvR基因敲除株,高渗透压环境虽能增加OmpK36表达,但增加幅度较野生株降低。高盐渗透压环境提高肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素头孢西丁和头孢唑林的敏感性,这种渗透压调控细菌对头孢西丁和头孢唑林的敏感性的作用在kbvR基因敲除株中下降。DAP-seq结果发现8个KbvR预测的可能结合基序并在ompK36基因起始密码子上游-248 bp至-253 bp处发现存在一个KbvR的可能结合基序,MST实验证实KbvR可以直接正调控ompK36基因表达（Kd=0.45±0.06μM）。生物信息学分析在KbvR上游启动子区存在全局性调控因子Fis的结合位点,MST实验证明KbvR受到全局性调控因子Fis直接调控。结论:（1）KbvR调控因子参与肺炎克雷伯菌对渗透压环境的感应及对抗生素敏感性的调控。（2）KbvR可通过直接调控外膜蛋白OmpK36表达影响细菌外膜通透性而影响细菌对抗生素的敏感性。外界环境中的渗透压可通过调控KbvR的表达从而下调OmpK36合成从而影响细菌对抗生素的敏感性。（3）KbvR受到全局性调控因子Fis的直接调控。本研究分析了高盐渗透压环境刺激对肺炎克雷伯菌生长、外膜蛋白表达、外膜通透性以及耐药性的影响及其可能的调控机制。证明肺炎克雷伯菌可通过全局调控因子Fis影响KbvR调控因子表达,从而调控细菌外膜蛋白OmpK36合成,导致细胞膜通透性降低,影响细菌对头孢西丁和头孢唑林的药物敏感性。