肺癌是临床最常的恶性肿瘤,虽然目前的手术、靶向药物和免疫治疗显著改善了患者的生存和预后。但是仍然有大量肺癌患者接受以化疗为主的传统治疗,患者存在严重的不良反应和耐药导致生活质量和预后差。因此,发展有效的、副作用低的、经济的实惠的肿瘤治疗药物和策略效果是肺癌临床和基础研究的一个重要课题。中药及其来源的化合物在抗肿瘤研究和应用中具有强大的应用潜力。其中,中药斑蝥及其来源的化合物被证实对多种人类肿瘤（包括肺癌）具有显著的抑制作用。但是斑蝥及其药效成分的抗肿瘤机制仍未完全阐明;考虑到中药多活性成分、多靶点、多途径的作用特征,我们首先采用网络药理学和生物信息学系统分析斑蝥的药效成分及其在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）的作用靶点。结果发现斑蝥的有效成分斑蝥素可能通过BIRC5作用于非小细胞肺癌,BIRC5对应的蛋白被称为生存素（Survivin）。目前的研究表明Survivin在多种肿瘤中高表达促进肿瘤的恶性进展,机制上Survivn主要促进细胞增殖和周期、抑制细胞凋亡。然而,最近的研究表明BIRC5对应的Survivin可能是一个新的细胞自噬调控蛋白。而斑蝥素的抗肿瘤作用与细胞自噬的调节密切相关。为此本课题主要采用网络药理学和生物信息学系统探究中药斑蝥抗非小细胞肺癌的分子机制;并进一步子在细胞实验和动物实验中探究和验证斑蝥药效成分斑蝥素通过BIRC5调节细胞自噬抑制NSCLC细胞的作用机制。第一部分:网络药理学和生物信息学分析中药斑蝥抗非小细胞肺癌的作用靶点[目 的]采用网络药理学和生物信息学分析中药斑蝥中的活性成分在非小细胞肺癌中的关键作用靶点[方 法]从TCMSP、Pubchem、Drug Bank获取和过滤中药斑蝥的主要活性成分及其对应的靶点信息;从TCGA和GEO数据库下载非小细胞肺癌样本转录组测序的FPKM数据。采用Rstudio分析对照样本和癌组织样本的基因表达差异。其中,limma包被用于筛选NSCLC样本的差异表达的基因。GeneCards、OMIM、GenCLiP3和DisGeNET数据库被用于补充NSCLC相关的疾病基因。Jvenn被用于斑蝥活性成分靶基因和NSCLC相关的疾病进行一致基因筛选。clusterProfiler包被用于斑蝥在NSCLC中的候选靶点的GO和KEGG富集分析。glmnet包对候选靶点进行LASSO回归分析,Spearman相关性分析被应用于lasso回归结果中signature基因的表达与非小细胞肺癌的临床特征相关性分析。survival包被用于特征基因的生存分析。Autodock被用于斑蝥活性成分及其对应靶点的分子对接验证分析。[结 果]TCMSP数据库中获得了 27个斑蝥活性成分其中,符合OB＞20%及 DL≥0.1 的活性成分共 5 个,分别是:cantharidin,EIC,oleic acid,octadec-7-enoic acid,及3-Phenyl-4-azafluorene。活性成分对应的药物靶点来自TCMSP和Drug Bank数据库,去重后共获得1445个靶点。TCGA数据库的非小细胞肺癌样本和对照样本获得2096个差异基因,GEO数据库来源的非小细胞转录组数GSE81089中获得2096个差异基因。NSCLC差异基因与斑蝥活性成分对应靶点的交集获得154个基因。基于154个候选靶点的LASSO回归分析构建了一个包含10个基因的非小细胞肺癌预后风险模型。Spearman相关性分析和生存分析结果表明 CA4,CRABP2,LYVE1,PDE2A,PLA2G1B,SLC4A4 及 TEK 与 NSLC患者的预后显著相关。分子对接结果表明斑蝥中的三种活性成分CDT、FMT、3-Phenyl-4-azafluorene 可能分别靶向 BIRC5、PLA2G1B、TEK（Tie2）抑制非小细胞肺癌的进展。[结 论]中药斑蝥素中的三种活性成分CDT、FMT、3-Phenyl-4-azafluorene 分别靶向 BIRC5、PLA2G1B、TEK（Tie2）抑制非小细胞肺癌的进展。第二部分:体内与体外实验探究斑蝥素通过BIRC5调节细胞自噬抗非小细胞肺癌的分子机制[目 的]在体外细胞实验和体内动物实验水平探究和验证斑蝥素通过BIRC5对非小细胞肺癌自噬和恶性进展的抑制作用。[方 法]体外细胞实验培养非小细胞肺癌细胞株A549,MTT实验检测斑蝥素对A549细胞的IC50值,选择合适的浓度进行后续实验,检测斑蝥素对A549细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、凋亡和自噬的作用。为探究BIRC5对A549细胞的恶性行为和自噬的作用,设置对照组、BIRC5过表达组、BIRC5敲降组,检测BIRC5表达变化对A549细胞恶性行为和自噬的作用。为探究斑蝥素通过BIRC5抑制肺癌细胞的生物学效应,设置对照组、斑蝥素处理组、斑蝥素处理联合过表达BIRC5、斑蝥素处理联合自噬抑制剂3MA处理组,检测肺癌细胞的恶性行为和自噬的变化,证实斑蝥素通过抑制BIRC5促进自噬发挥抗肿瘤作用。为探究BIRC5通过ATG5和ATG7对A549细胞恶性行为和自噬的作用,设置对照组、过表达BIRC5组、过表达BIRC5+过表达ATG5组、过表达BIRC5+过表达ATG7组。检测肺癌细胞的恶性行为和自噬的变化,证实BIRC5高表达通过作用于ATG7和ATG5对细胞恶性行为和自噬的作用。为探究斑蝥素通过抑制BIRC5激活ATG5和ATG7促进自噬抑制非小细胞肺癌恶性进展,设置对照组、斑蝥素组、斑蝥素+敲降ATG5组、斑蝥素+敲降ATG7组。检测肺癌细胞的恶性行为和自噬的变化,证实斑蝥素通过上调和激活ATG5和ATGT促进细胞自噬发挥肿瘤作用。为满足细胞实验的分组要求,我们构建BIRC5、ATG5、ATG7的过表达质粒和敲降序列,并转染A549细胞;RT-qPCR和Wesetrnblot检测过表达和敲降效果。CCK-8实验检测细胞增殖活力;平板培养克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡。透射电镜（TEM）观察自噬小体;免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ、ATG5和ATG7的表达。Western blot检测自噬相关蛋白,ATG5、ATG7、p62、LC3 Ⅱ等的表达。体内动物实验采用慢病毒转染分别构建BIRC5稳定过表达、ATG5和ATG7稳转敲降的A549细胞,Western Blot检测各组目的基因的过表达和敲降效率。进一步采用正常A4549细胞、稳转过表达BIRC5、稳转敲降ATG5、稳转敲降ATG7的A549细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型。为验证斑蝥素通过抑制BIRC5发挥抗肿瘤作用,动物实验设置移植瘤模型对照组（NC）、斑蝥素组（CTD）、斑蝥素干预的BIRC5过表达组（CTD+OE-BIRC5）。为探究斑蝥素的抗肿瘤作用依赖于ATG5和ATG7的功能,动物实验设置移植瘤模型对照组（NC）、斑蝥素组（CTD）、斑蝥素干预的ATG5敲降组（CTD+sh-ATG5）、斑蝥素干预的ATG7敲降组（CTD+sh-ATG7）。皮下移植瘤构建一周后注射斑蝥素进行干预。所有动物饲养至6周后处死进行组织学和分子生物学检测。饲养期间检测移植瘤体积,绘制肿瘤生长曲线;4周后麻醉处死各组裸鼠剥瘤称重。TUNEL染色检测移植瘤组织细胞凋亡。[结 果]细胞实验中,斑蝥素对A549的半数抑制浓度（IC50值）为3.12μg/ml。1μg/ml、2μg/ml和4μg/ml浓度的斑蝥素显著导致A549细胞的恶性行为抑制,显著促进细胞自噬。BIRC5的功能实验结果表明过表达BIRC5显著促进A549细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,显著降低细胞凋亡和自噬;而敲降BIRC5显著抑制A549细胞的恶性行为,促进细胞凋亡和自噬。过表达BIRC5显著降低了斑蝥素对A549细胞恶性行为的抑制作用;显著降低了斑蝥素诱导的细胞自噬。与单独过表达BIRC5相比,同时过表达ATG5、同时过表达ATG7均显著抑制了 A549细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,促进凋亡和自噬水平。这些结果表明,BIRC5通过抑制ATG5和ATG7降低细胞自噬。与斑蝥素处理组相比,斑蝥素处理的同时敲降ATG5和敲降ATG7均显著恢复了 A549细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移,并显著降低细胞凋亡。电镜观察和免疫荧光结果也表明敲降ATG5和敲降ATG7显著消除了斑蝥素导致的细胞自噬升高。这些结果表明斑蝥素抑制BIRC5通过促进ATG5和ATG7功能增强细胞自噬发挥抗肿瘤作用。动物实验结果表明,与对照组相比斑蝥素显著抑制A549细胞皮下移植瘤的生长,促进移植瘤组织细胞凋亡;而斑蝥素对过表达BIRC5组裸鼠移植瘤的抑制作用显著降低。并且与斑蝥素干预组相比,敲降ATG5和敲降ATG7显著消除了斑蝥素对皮下移植瘤的抑制作用。[结 论]斑蝥素通过抑制BIRC5促进自噬相关蛋白ATG5和ATG7的功能增强细胞自噬发挥抗肿瘤作用。BIRC5是非小细胞肺癌自噬干预的新靶标。