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微小RNA(miRNA)是一类非编码单链RNA分子,长度约为18～24 nt。miRNA通过调控基因的转录水平、mRNA的稳定性以及转录后翻译等过程。影响基因的表达,在细胞凋亡、细胞分化、衰老、癌变等过程中产生重要的影响。在克隆牛胚胎的发育过程中,可能会出现胚胎发育异常的现象,例如发育阻滞以及胚胎形态和质量异常等,尤其在克隆牛胚胎发育的早期容易发生异常。可能是因为克隆胚胎中没有精子的参与,缺失精子来源物质的调控,从而引起克隆胚胎的异常发育。因此对精子特异性高表达的miRNA可能在牛胚胎早期发育过程中起到的作用进行研究。本试验取得的主要结果如下:1.通过miRNA定量确定Bta-miRNA-182为精子特异性高表达的miRNA,并通过生物信息学方法筛选出靶基因ACVR1、CFL1和ZFP36L1,可能在早期胚胎发育中起调节作用。2.分别构建了靶基因ACVR1、CFL1和ZFP36L1的双荧光报告载体,使用双荧光素酶报告基因法检测靶基因的表达量。使用Lip 2000进行靶基因质粒和miRNA mimic的共转染,转染至293T细胞。与对照组相比,miRNA-182 mimic共转染组的CFL1及ACVR1的荧光强度明显降低(p<0.05),而ZFP36L1的荧光强度变化不明显。之后通过实时定量PCR(qPCR)检测ACVR1、CFL1和ZFP36L1的变化情况,结果显示CFL1、ZFP36L1在与miRNA-182共转染以后表达水平明显降低(p<0.05)。结合基因的相关功能分析,筛选CFL1为miRNA-182的靶基因。Western Blot试验将mimic电转染至成纤维细胞,试验结果表明,与Negative control mimic(NC mimic)和inhibitor组相比,miR-182 mimic电转染组中CFL1的蛋白表达水平显著降低(p<0.05),证明CFL1为miRNA-182的靶基因。3.按梯度浓度注射miR-182 mimic到胚胎中,通过qPCR筛选出最合适的miR-182 mimic浓度。对早期胚胎注射最适浓度的miR-182 mimic,免疫荧光染色结果显示胚胎2-细胞和4-细胞时期的CFL1的表达水平显著降低(p<0.05)。鬼笔环肽染色结果显示,miR-182 mimic注射组2-细胞和4-细胞时期的肌动蛋白表达水平显著升高(p<0.05)。说明miR-182通过靶向CFL1调控肌动蛋白的表达。此外,与SCNT、孤雌胚胎的卵裂时间相比,miR-182 mimic注射组更接近IVF胚胎,注射后提高了胚胎的发育囊胚率(p<0.05),降低了胚胎囊胚凋亡细胞数(p<0.05)。然后筛选出对CFL1具有明显抑制作用的小分子干扰RNA片段si-429,注射si-429后发现2-细胞时期CFL1的表达水平明显降低(p<0.05),囊胚率明显升高(p<0.05)。试验表明,精子特异性高表达的miR-182通过对靶基因CFL1的调控,影响肌动蛋白的表达,与IVF胚胎的卵裂时间接近,提高了早期胚胎的发育囊胚率。