病原体严重威胁着人类的生命健康,同时也带来了巨大的经济损失。它不仅会造成传染病的流行和爆发,部分病原体还会导致癌症。为了研发更有靶向性的药物,更好地预防、治疗病原体造成的疾病,深入了解病原体与其宿主细胞相互作用的机制至关重要。病原体在活细胞中的侵染、复制是连续、动态、复杂的过程,然而传统的研究病原体的方法主要基于对固定细胞的分析,给出静态的、时间和群体平均化的结果,无法实时、动态地展示病原体与宿主细胞相互作用的过程,从而忽略了很多短暂但是重要的作用过程的信息。因此在本论文中,我们利用基于荧光显微镜的单颗粒／单分子示踪技术,以伪狂犬病毒和炭疽杆菌作为两种病原体的代表,研究他们与活细胞的相互作用机制。围绕这一主题,我们展开了以下工作：为了可视化研究病毒在活细胞中完整的生命周期,我们发展了一种分别定点标记亲代病毒和子代病毒的普适性策略。利用反向遗传学技术,在病毒衣壳上定点表达HaloTag蛋白,通过HaloTag蛋白和其荧光标记的配体之间快速、不可逆的共价反应实现对病毒衣壳的定点荧光标记。标记可在病毒扩增过程中实现,因此得到的荧光标记的病毒可以直接用于单颗粒示踪实验,避免了繁琐的纯化步骤以及进一步的修饰过程,最大程度地保持了病毒的结构完整性和侵染活性。由于HaloTag蛋白的荧光配体具有多样性,因此我们首次实现了用不同发射波长的荧光染料修饰的配体对亲代病毒和子代病毒的分别标记。该标记方法为病毒在活细胞中生命周期的可视化奠定了基础。在上述建立的标记策略的基础上,我们利用基于共聚焦显微镜的单颗粒示踪技术,对伪狂犬病毒在活细胞内的生命周期进行了实时、原位、动态的可视化研究。我们监测了(i)病毒在细胞表面与受体结合,(ii)病毒衣壳进入细胞后在细胞质中沿微管向细胞核周围转运,(iii)病毒衣壳锚定在细胞核上释放核酸,(iv)子代病毒衣壳在细胞核中的受限运动以及(v)子代病毒衣壳转运到细胞质中进一步组装、释放的过程。我们对这五个阶段中,伪狂犬病毒的运动行为及其与宿主细胞的相互作用进行了探讨。此外,结合病毒包膜的标记策略,实现了对伪狂犬病毒衣壳和包膜的同时标记,发现伪狂犬病毒的入胞方式是依赖于细胞系的。在Vero细胞中,伪狂犬病毒的包膜与细胞质膜发生融合,将衣壳释放到细胞质中；而在HeLa细胞中,则是利用受体介导的内吞作用进入细胞。此外,我们以炭疽杆菌为例,研究了细菌与宿主细胞的相互作用机制。用单个荧光染料分子对含有单个半胱氨酸残基的炭疽毒素保护性抗原突变体进行了荧光标记,并用于单分子示踪研究。利用基于全内反射显微镜的单分子示踪技术,首次实现了保护性抗原在细胞表面寡聚化过程的可视化,发现保护性抗原在细胞表面形成寡聚体的过程依赖于胆固醇,形成的寡聚体会募集特定的糖鞘脂(如神经节苷脂GM1)和糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(如尿激酶型纤溶酶原激活因子受体uPAR),形成脂筏,从而进一步稳定寡聚体。在这个过程中,保护性抗原寡聚体还会募集微丝相关蛋白Arp3和N-WASP,在寡聚体位点组装产生微丝,限制寡聚体在细胞表面的扩散运动,为后续入胞打下基础。