论文部分内容阅读
褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺,melatonin)主要是由动物松果体分泌的胺类激素,作用于全身的多个器官、组织、细胞,具有调节生物节律、改善睡眠,调节免疫系统、增强免疫力,调控生殖活动,抗氧化作用,抗衰老功能,抗肿瘤功能及清除体内自由基等多种生理和药理作用。芳烷基胺N-乙酰基转移酶(AANAT)是脊椎动物中褪黑素生物合成的主要限速酶。本研究利用转基因技术,将AANAT基因转入奶山羊的基因组中,一是生产全身过表达AANAT的奶山羊,并以此为模型研究内源高水平褪黑素对个体繁殖和免疫的影响;二是培育出乳腺特异性过表达AANAT的奶山羊,并生产高水平褪黑素羊奶。利用体细胞核移植转基因技术生产全身过表达AANAT的崂山奶山羊。首先成功构建pIRES2-EGFP-AANAT和CAG-AANAT全身表达载体。采集35d左右的崂山奶山羊胎儿,并利用组织块贴壁培养法分离培养崂山奶山羊胎儿成纤维细胞。利用电穿孔方法转染胎儿成纤维细胞,经G418及绿色荧光筛选后,挑出阳性单克隆细胞系,扩大培养并进行DNA水平的阳性鉴定,mRNA水平和蛋白水平的表达检测,选出3个细胞系作为核移植供体细胞。通过对33只奶山羊供体超数排卵处理,共冲出472枚MⅡ期卵母细胞,通过体细胞核移植获得融合胚胎371枚,并将其分成两组培养,培养液中添加10-7M褪黑素组与未添加组相比妊娠率(37.5%vs.6.25%)和产羔率(50%vs.0)都显著提高。获得7只成活的克隆羊,PCR-Sequencing和Southern blot检测其均为AANAT转基因阳性个体。qRT-PCR及Western Blot分析转基因克隆羊各组织AANAT的表达量都显著升高。通过放射免疫测定转基因克隆羊血清褪黑素水平显著高于野生型山羊。另一方面,利用原核胚显微注射结合CRISPR/Cas9基因编辑技术生产乳腺特异性过表达AANAT的崂山奶山羊。成功构建了以酪蛋白启动子驱动的pBCl-AANAT乳腺特异性表达载体。崂山奶山羊作为供体进行超数排卵,采用CIDR+促卵泡素(FSH)慢减量4天7针+PMSG+LH注射法,总计对169只崂山奶山羊供体进行超排,获总冲胚数2278枚,平均每只供体冲胚数13.48枚。供体原核胚显微注射乳腺特异表达载体pBCl-AANAT后移植给受体,移植受休总计433只,妊娠率19.86%(86/433),平均产羔率为21.02%(91/433)。PCR扩增阳性率为15.38%(14/91)。通过放射免疫测定转基因阳性羊奶中褪黑素水平显著升高。此外,利用高水平褪黑素转基因山羊模型,研究了其外周血单核细胞(PBMCs)的抗炎症能力。首先,半定量分析发现PBMCs能够表达AANAT，HIOMT和MTNR1B(MT2)。LPS刺激体外分离培养的PBMCs后,过表达AANAT转基因奶山羊的PBMCs细胞分泌高水平的褪黑素,其可与MT2受体结合并激活胞内p38 MAPK信号通路促进PBMCs自噬,降低PBMCs的过度炎症反应。与体外培养的PBMCs炎症反应不同,体内注射LPS后,转丛因羊高水平的褪黑素抑制PBMCs内的ERK MAPK信号通路,并同时通过上调抗氧化丛因的表达提高细胞抗氧化应激能力,降低自噬相关基因的表达从而降低自噬活动,升高血清中促炎性细胞因子,增强机体的炎症反应。LPS处理后体内外PBMCs不同的炎症反应表明其所处状态的重 要性。本研究生产出的内源性高水平褪黑素转基因羊为个体繁殖、免疫炎症等功能的研究提供了基础。