蛋白质谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.44,protein glutaminase,PG）是近年来广泛关注的脱酰胺酶,属于酰胺基水解酶类。PG可以水解大分子蛋白质和一些小肽侧链的谷氨酰胺并生成蛋白质L-谷氨酸和氨,从而改善蛋白质的各项功能性质,降低植物蛋白酶的致敏性,在食品、生物医药以及化妆品等行业具有应用。PG最初报道来源于解朊金黄杆菌（Chryseobacterium proteolyticum）,存在产酶水平低、遗传操作困难等问题,而利用基因工程菌发酵生产PG,具有成本低,周期短、蛋白表达水平高等优势,成为实现PG高效表达的主要策略。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是食品级安全菌株,具有异源蛋白表达效率高,PG酶原（pro-PG）可以实现自活化等特点,成为PG异源活性表达的主要宿主。本课题通过对不同枯草芽孢杆菌表达宿主的比较、表达元件组合优化、PG半理性分子改造、枯草芽孢杆菌毒素-抗毒素（toxin-antitoxin,TA）表达系统构建及发酵优化等策略,实现PG在枯草芽孢杆菌中的高效表达。主要结果如下:（1）以pP43NMK作为载体骨架,将pro-PG基因prg A和成熟酶（m PG）基因分别在枯草芽孢杆菌168、WB600以及WB800菌株中重组表达,并研究pro-PG在枯草芽孢杆菌中活化过程。结果表明pro-PG在枯草芽孢杆菌WB600和168中均可以实现自活化,其中枯草芽孢杆菌WB600中表达pro-PG最优。通过m PG N端氨基酸测序发现,枯草芽孢杆菌表达的m PG比解朊金黄杆菌表达的m PG多一个赖氨酸,但酶学性质相似。（2）针对表达载体中启动子、信号肽和N端序列等元件进一步优化,提高PG表达水平。启动子替换结果显示,启动子Yvy D、Com A和Sec A可以有效提高70%、136%和32%的PG酶活。在启动子Sec A基础上进一步替换信号肽,Tat途径的信号肽Yde J使酶活提高114%,达到3.37 U·m L-1。通过融合Ydbp的N端,酶活提高228%,达到4.96 U·m L-1。为了进一步提高发酵酶活,在摇瓶上进行氮源、碳源等单因素优化实验,最后在发酵罐上进行通氧量、搅拌速度及补料分批发酵优化,使PG在发酵40 h后酶活达到7.07 U·m L-1。（3）通过计算机分子模拟对PG与底物结合相关的位点进行预测,结合丙氨酸扫描结果,选取G155、L265、N272、V276和P290位点构建饱和突变体文库。采用银纳米颗粒方法进行初筛,将初筛得到的正向突变再通过摇瓶复筛,获得的突变体N272W和L265S,酶活分别提高4%和14%。（4）为了解决PG表达不稳定以及抗生素添加的情况,基于枯草芽孢杆菌内源Endo A（毒素）-Endo B（抗毒素）TA系统,初步构建枯草芽孢杆菌WB600 TA表达体系。通过人工调控内源Endo A与Endo B的表达,由阿拉伯糖诱导型启动子PBAD调控的Endo A表达盒整合到基因组中,由组成型启动子P43调控表达的抗毒素Endo B表达盒被克隆到PSec A-Yde J-pro-PG载体中,该系统有效避免了抗生素的添加。