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肝细胞性肝癌（简称肝癌，Hepatocellular Carcinoma，HCC）是我国最常见的高发肿瘤之一，在我国恶性肿瘤死亡率中居第二位，在某些农村地区居第一。现在全世界每年新发生50-60万例肝癌，其中42.5％发生在我国。其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。目前，尽管已经鉴定了一些肝癌的抑癌基因，如p53和p16INK4A，并明确了它们在肝癌中的特异性失活，但是在肝癌发生中特异性激活的癌基因却少见报道。2000年日本科学家Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞癌组织高表达的基因中筛选出一条编码重复ankyrin序列的新基因，被命名为gankyrin。我们检索基因库后发现gankyrin基因与1998年Hori等人发现的p28（Nas6p）基因序列完全一致，遂将其命名为p28GANK。 本实验室前期对癌基因p28GANK做了大量的研究工作。Northern blot杂交显示，p28GANK基因在64例人肝癌组织中，其mRNA的检出率为96.9％（62／64），其中癌较癌旁组织表达明显升高的占91.9％（57／62），在正常肝组织中未检测到其mRNA的表达。对肝细胞癌细胞系HepG2、Hep3B、Huh7、PLC／PRF／5、Sk-Hep-1、Chang liver、SMMC-7721的检测显示，p28GANK基因也呈现高表达状态。p28GANK基因其致癌性可能与其蛋白通过高磷酸化并降解抑癌蛋白Rb1，促使细胞由G1期向S期转化有关。Rb1与E2F转录因子相结合共同调控下游基因的表达，这些基因的开放与细胞的增殖分裂有关。Rb1-E2F转录复合物的功能受到CDK4-CyclinD1一p16INK4a信号通路的调控。我们与国外实验室的研究证明，p28GANK与细胞周期激酶CDK4相结合，提示其在CDK4-CyclinD1-p16INK4a-Rb1-E2F信号转导通路中的调节作用。 p28GANK从基因作为近几年才发现的新基因，对其功能的研究还有待进一步的深入。本研究运用反义遗传方法（RNA interference,RNAi）对p28GANK基因的功能作进一步的研究，以增加对其功能的认识。RNAi是通过双链RNA（dsRNA）介导的特异性地降解相应序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。众多研究人员对植物、真菌、线虫、果蝇及哺乳动物进行了大量的研究证实，RNAi现象存在于大多数从低等到高等生物物种中。这说明RNAi作用是自然界相当保守的生物模式，也意味着RNAi方法的应用范围十分广泛。相对基因打靶而言，RNAi是一种非常有效而又简单易行的基因敲除方法，在特异并高效抑制基因功能方面显示了广阔的前景。目前RNAi技术被应用在癌基因功能的研究中，并已经成功取得第二军医大学2001级博十毕业论文中文摘要对某些癌基因的RNAi，这为基因功能的研究提供了一种崭新的方法，而且为肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路。 RNAi实验时，靶位点的设计是RNAi成功的关键。目前，RNAi的实施方法有五种。化学合成21一23bp的siRNA虽然能有效降低靶基因的表达，但合成费用昂贵而限制了其广泛应用;载体介导的RNAi适合特异性靶位点选出后的研究，用于靶位点的筛选比较繁琐;鸡尾酒法和siRNA表达框这两种方法也不适合基因靶位点的筛选。因此我们采用T7体外转录法获取siRNA可以避免上述几种方法的缺点。我们首先建立体外转录体系，并选用已知的干扰绿色荧光蛋白的特异性靶位点作为阳性对照，采用脂质体法瞬时转染293T细胞，验证体外转录体系的可行性。48小时后荧光显微镜下绿色荧光蛋白的亮度明显减弱，W七stem blot的结果也显示GFP蛋白的表达下降了约80%。这说明我们建立的体外转录体系是可行的，并进一步优化此体系的各项实验参数，建立了完善的T7体外转录体系。我们这种体外获取siRNA的方法具有简便、快速、费用低及高效的特点，这为p28侧袱和其它基因的靶位点的选择及反向遗传研究奠定了坚实的基础。综合目前RNAi的资料来看，大多数基因特异性的靶位点一般都选择在mRNA的编码区内，其序列可位于编码区的5’端，中间位置及3’端。但是，针对靶基因mRNA的非编码区（5’UTR，3’UTR）进行RNAi的报道也逐渐增多。我们在p28引NK基因的编码区内根据靶位点的设计原则，并根据RNAStructure3.71预测RNA的二级结构，选择三段靶序列，分别位于其5’端、靠近中间位置及3’端，利用T7体外转录体系生成siRNA，和p28GANK质粒同时瞬转人胚肾293T细胞，用Real一Time PCR和W己stem blot鉴定三个靶位点对p28翻服基因mRNA的干扰效果。结果显示其中一个靶位点可降低p28引袱mRNA的表达水平80%，另外两个靶位点分别是降低38%及没有作用。我们把这个特异性siRNA转染肝癌细胞系，也可以显著降低p28洲NKmRNA的表达。为进一步研究p28洲NK在肝癌细胞中的作用，又把这个特异性siRNA对应的DNA双链序列克隆入腺病毒载体内，包装成腺病毒作进一步的研究。 我们选用IMoENEx公司的腺病毒载体（oenesuPpressorTMsystem）作为转染平台进行RNAi的研究。分别选用了高表达p28GANK的肝细胞癌细胞系HePGZ、HeP3B、Huh7、PLC/PRF/5、SMMC一7721等对其进行比较分析。Real一Time PCR和W七stern blot结果显示腺病毒载体用于干扰基因的表达是可行的。癌基因p28GA肤RNAi后，MTT第二军医大学2001级博士毕业论文中文摘