目的:利用免疫学的方法制备中药虎杖各成分的抗原、抗体并进行特异性检测。方法:首先分别制备虎杖的全成分抗原,然后分别应用琥珀酸酐法、重氮化对氨基苯甲酸法以及改良的重氮化对氨基苯甲酸法将标准品大黄素与小牛血清白蛋白(BSA)连接,用以上各抗原免疫昆明小鼠,制备抗血清。结果:1大黄素-BSA抗原的连接效果用紫外分光光度计扫描大黄素、BSA、PBS、大黄素-BSA1、大黄素-BSA2和大黄素-BSA3,其结果见图3至图7。由图可见,判断大黄素已与BSA连接。依紫外吸收测定结果,按公式计算大黄素-BSA的结合比见表1。2各组抗原免疫小鼠抗血清的抗体效价及其免疫原性比较用醋酸纤维滤纸双向免疫扩散法,取虎杖水提液(含所有虎杖成分抗原)1:10作抗原,与各组抗血清反应,检测抗血清效价,判定各组抗原的免疫原性。在虎杖粗提抗原各组中,虎杖水提醇沉物组抗血清的抗体效价最高为1:16,即免疫原性最强;其次虎杖水提液组为1:4,免疫原性较弱;虎杖水提醇沉上清组为1:2,免疫原性相对最弱。在纯提大黄素抗原各组中,抗体效价依次为大黄素-BSA3组为1:8、大黄素-BSA2组为1:4、大黄素-BSA1组为1:2。因此,可以判定大黄素-BSA3组免疫原性最强,大黄素-BSA1组免疫原性相对较弱;单纯大黄素没有免疫原性(见表2)。3大黄素-BSA不同连接法对免疫动物抗体的特异性影响选择大黄素不同基团与BSA连接,必然影响半抗原的表达结构,产生不同的抗原表位,免疫动物必然影响其免疫原性和抗体的特异性。采用Western印迹改良法检测大黄素-BSA不同连接法免疫动物产生抗体对相似结构大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚特异性或交叉反应的反应性。用琥珀酸酐法连接的大黄素-BSA1组产生的抗大黄素抗体,除了与大黄素结合外,也能与大黄素甲醚、大黄酚发生交叉反应;而用重氮化对氨基苯甲酸法连接的大黄素-BSA2组产生的抗大黄素抗体,仅与大黄素特异性结合,不与大黄素甲醚、大黄酚发生交叉反应;用改良的重氮化对氨基苯甲酸法连接的大黄素-BSA3组产生的抗大黄素抗体,与大黄素高度结合,与大黄素甲醚、大黄酚发生可疑性交叉反应。但三者均不与大黄酸发生交叉反应(见表3)。4虎杖粗提液免疫小鼠产生抗小分子成分抗体的情况中药大分子成分(如中药蛋白、多糖等),可直接刺激动物产生抗体,但在理论上讲,小分子半抗原成分不能直接刺激动物产生抗体。实验发现:虎杖粗提液(包括虎杖水提液、虎杖水提醇沉物、虎杖水提醇沉上清)免疫小鼠,均产生了不同程度的抗大黄素抗体、抗大黄酸抗体、抗大黄素甲醚抗体和抗大黄酚抗体。其中以虎杖水提醇沉物组产生的抗体最全面和效价最高。但直接用纯化的大黄素免疫,不产生抗体(见表4)。5虎杖粗提抗原免疫动物的抗体特异性比较分别用虎杖粗提液和与其遗传上相差甚远、不含有相同成分的白花蛇草水提液免疫小鼠,制备抗血清。通过醋酸纤维滤纸双向免疫扩散法检测其抗体特异性,结果见表5。各组抗虎杖粗提液抗血清只与虎杖水提液发生反应,与大黄水提液发生轻度交叉反应,但均不与白花蛇草水提液发生反应;白花蛇草水提液抗血清只与白花蛇草发生反应,均不与虎杖水提液发生反应。结论:1大黄素-BSA连接方法对特异性的影响琥珀酸酐法连接的大黄素-BSA复合物,免疫小鼠产生的抗体,不仅与大黄素结合,也能与大黄素甲醚、大黄酚交叉结合。重氮化对氨基苯甲酸法及其改良法连接的大黄素-BSA复合物,可保留大黄酸的6-OH,即保留了大黄酸的特征结构。免疫小鼠产生的抗体(抗血清),主要与大黄素结合,但在高浓度抗体存在下也与大黄素甲醚交叉结合。2大黄素与BSA连接方法和结合比对小鼠免疫原性的影响同一种连接方法,连接到载体的半抗原的量(即结合比),在一定范围内,结合比越高,半抗原的免疫原性就越大。影响其免疫原性除了与其结合比有关外,更与其连接方法有关,这可能与不同连接法对大黄素的抗原表位结构的免疫原性和大黄素-BSA复合物形成的半抗原的抗原表位种类和数量有关。3各抗原组免疫原性与特异性在虎杖粗提液各组中,水提醇沉物组主要含有大分子蛋白质和多糖,免疫原性最强。虎杖粗提液免疫小鼠制备的抗血清,能与虎杖水提液发生抗原抗体反应,不与无关的白花蛇草水提液发生反应。证实其抗体具有种属特异性。它能与同属科大黄水提液发生轻度的交叉反应,这与同一科属的虎杖和大黄在遗传上具有一定的同源性,含有同源性蛋白和共同小分子成分有关。4虎杖粗提液免疫小鼠可以产生抗小分子成分抗体用虎杖粗提液免疫小鼠,可产生不同程度的抗小分子成分抗体(如抗大黄素抗体、抗大黄酸抗体、抗大黄素甲醚抗体和抗大黄酚抗体)。其中以主要含有虎杖蛋白和多糖大分子成分的水提醇沉物组产生的抗体最全面和效价最高,并以抗大黄素抗体含量最多。提示制备某些中药小分子成分抗体,可直接用水提醇沉物免疫动物,也可以获得。