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方剂是中医临床用药的主要形式,复方的效用不是所组成的各单味药及其化学成分的简单相加,而是其多种组分共存及共同作用的结果。研究方剂效用物质基础是中药现代化基础研究的重要领域,对于在物质层面揭示方剂的科学原理和促进我国中药质量水平的提高都有重大意义。本课题是以中医方剂学学理为基础,以小柴胡汤中核心功能药对的水煎液为研究对象,选择与柴胡—黄芩药对功效密切相关的退热作用为效应指标,考查柴-芩药对中的化学部位及其配伍与退热效用之间的关系；在获得优化部位配伍的基础上,进一步探查有效组分配伍的退热作用机制。研究一发热小鼠模型的研究方法：NIH雄性小鼠,25-30g,30只,小鼠于23℃左右室温下适应性饲养3-5d,第4、5d每日测体温(肛温)2次。取肛温的平均值作为基础体温,选用体温波动范围不超过38.0℃,且2次测体温波动均不超过0.4℃的小鼠。将符合实验条件的小鼠随机分为正常组、模型组1组、模型2组,每组10只。实验前6h禁食不禁水。小鼠模型1和模型2组分别给予110μg/kg,200μg/kg的LPS腹腔注射,诱发动物发热；正常组注射等体积的生理盐水。分别测定各组小鼠腹腔注射后0,30,60,120,180,240,330min时的肛温和各时间点的体温差值△T(实测肛温-初始肛温),绘制各组平均体温的变化曲线。结果：与正常组比较,模型1和模型2组小鼠30min后的各时间点的肛温均呈显著性升高(P<0.01,P<0.05)；与模型2组比较,模型1组60min后各时间点的肛温均见显著性降低(P<0.05)。结论：腹腔注射200μg/kg的LPS可明显引起NIH小鼠的体温升高,且其发热持续时间较长。研究二不同分离方法对柴-芩药对退热效用部位的探讨(一)水提醇沉法分离柴胡—黄芩水提液的研究实验1.柴芩水煎液与合并液对LPS诱导的发热小鼠△T的影响方法：用水提醇沉法将柴胡—黄芩水提液分离为A、B、C、D四个化学部位。观察各部位合并液与水提液对脂多糖诱导的小鼠发热模型的降温作用。结果：与正常组比较,模型组小鼠30min后各时间点的肛温均显著性升高(P<0.05)；与模型组相比,柴芩水煎液组与柴芩各部位合并液组小鼠30min后各时间点的肛温均呈显著性降低(P<0.05)；与柴芩水煎液组相比,柴芩分离各部位合并液组小鼠各时间点的肛温变化无明显差异(P>0.05)。结论：柴胡-黄芩药对水提液经醇沉所获各部位合并液的降温作用与柴黄-黄芩水提液作用相当,表明分离过程未引起其退热有效成分的损失实验2、柴胡—黄芩各部位配伍与退热作用关系的研究方法：将柴胡-黄芩水提液中分离的各部位按正交L.(2)7表分组配伍,依次配制成配方DA、CA、CD、BA、BD、BC、ABCD组(各部位剂量相当于原药材1g/mL的用量折算),在造模前半小时,按相当于原药10g/kg的浓度给NIH小鼠灌胃各部位配伍药液；测定各组小鼠腹腔注射LPS (200μg/kg)后60min、180min的肛温。结果：各部位组及CD交互组均能明显降低发热小鼠的肛温(p<0.01)。结论：各部位均有不同程度的解热作用,各部位之间存在着复杂的交互关系。(二)大孔树脂分离法探查柴胡—黄芩水提液的退热效用部位实验一大孔树脂初步分离柴胡—黄芩水提液方法：柴胡-黄芩水提液经AB-8型大孔树脂柱净化,依次用水,20%,40%,60%和90%乙醇梯度洗脱,通过化学反应检识,合并组成相近的流份得到a、b、c、d4个部位；观察各部位对脂多糖诱导的小鼠发热模型的退热作用。结果：柴胡-黄芩水提液经分离得到的4个部位分别为糖类(a)、皂苷类(b)、皂苷及黄酮苷类(c)、黄酮苷元及皂苷元(d)；4个部位均具有不同程度的退热作用(p<0.05),其中以d部位的退热作用最好(p<0.01)。结论：柴胡-黄芩水提液由大孔树脂分离出的各部位均有一定的退热作用。实验二、柴胡黄芩各有效部位配伍与退热作用的关系方法：将经大孔吸附树脂柱分离的柴胡-黄芩水提液中的4个部位a、b、c、d,按正交L8(2)7表分组配伍,方法同研究二中实验二。结果：柴芩各部位配伍组中以柴芩cd组、柴芩abcd组、柴芩abd组退热作用较好,其中柴芩cd组作用最优。柴芩最佳部位配伍为cd组。结论：柴胡-黄芩水提液由大孔吸附树脂柱分离所获部位及其配伍均有一定的退热作用,cd部分为其主要效用基础。研究三、柴胡黄芩有效部位配伍的退热作用机制的探查方法：选取柴胡-黄芩水提液经大孔吸附树脂柱分离所得部位,进行ab、abd、cd、abcd不同配伍,观察各部位配伍对发热小鼠模型相关指标的影响。结果：(1)与正常组比较,模型组小鼠外周血清中TNF-α、β-EP含量,下丘脑TNF-α、PGE2、cAMP、AVP含量均显著性升高(P<0.05、P<0.01)；(2)与模型组比较,柴-芩cd组、柴-芩abcd组小鼠外周血清中TNF-α、β-EP的含量均显著性降低(P<0.05),下丘脑中TNF-α、PGE2、cAMP的含量均显著性降低(P<0.05)；柴-芩abcd组小鼠下丘脑PGE2含量显著性降低(P<0.01),柴芩abd组小鼠下丘脑的cAMP含量显著性降低(P<0.01)；柴-芩各配伍组小鼠下丘脑AVP值均有降低作用趋势(P>0.05)。结论：LPS诱导的发热小鼠模型的发热机制涉及中枢介质(PGE2、cAMP、AVP)内生致热原TNF-α、脑肠肽(p-EP)多个环节的变化。柴芩相关部位配伍的退热作用机制主要涉及对体温中枢正调质PGE2、cAMP的调节及抑制内生致热原TNF-α、β-EP合成或释放,但不同部位配伍组的退热作用环节有所差异；退热效应大小与退热作用的环节多少有关。