论文部分内容阅读
胃癌(Gastric cancer, GC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，主要起源于胃腺上皮细胞，其死亡率排在癌症的第3位，中国是GC的高发国家，发病率和死亡率占全球的40%。由于GC发病的隐匿性，约70%的患者在首次确诊时已进入中晚期，针对中晚期的GC患者，传统治疗方法(手术、放疗和化疗)已无法明显提高患者生存率。近年来随着靶向药物的临床应用在一定程度上提高了中晚期GC患者的生存率和生活质量，但现有靶向药物还不能彻底治愈GC，因此需进一步探索GC发生发展的分子机制，为GC的诊断和治疗提供更有效的靶分子。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小型非编码RNA分子，长约18~25个核苷酸，可以结合mRNA的5端、3端或mRNA前体内含子调节mRNA表达，参与肿瘤细胞的增殖、转移和糖酵解。miRNA-520a-3p是miRNA-520家族成员，已被证实在非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和甲状腺乳头状癌中表达下调，并参与这些肿瘤细胞转移和增殖，但是miRNA-520a-3p在GC中的表达及对GC细胞增殖和糖酵解调控分子机制还需进一步探索。
第一部分：miRNA-520a-3p在胃癌细胞和组织中表达研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p在GC组织和细胞中的表达
研究方法：
提取GC组织和细胞的miRNA，利用RT-qPCR检测miRNA-520a-3p表达水平。
研究结果：
1.RT-qPCR检测结果显示：与癌旁正常组织比较，GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著下调；同时Ⅲ、Ⅳ期GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期GC组织(P＜0.01或P＜0.001)。
2.RT-qPCR检测结果显示：与正常胃上皮细胞(GES-1)比较，GC细胞AGS、MKN-28、MKN-45、BGC-823和SGC-7901中miRNA-520a-3p表达水平显著下调(P＜0.001)。
研究结论：
1.在GC组织和细胞中miRNA-520a-3p表达水平显著下调。
2.Ⅲ、Ⅳ期GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期GC组织。
第二部分：miRNA-520a-3p对胃癌细胞增殖和糖酵解作用研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p对GC细胞增殖和糖酵解的作用。
研究方法：
通过细胞转染技术，向AGS和MKN-28细胞分别转染过表达miRNA-520a-3p慢病毒(LV-miRNA-520a-3p)或对照慢病毒(NC)；此外，向AGS和MKN-28细胞分别转染miRNA-520a-3pinhibitor或对照物(NC)；然后利用CellCountingKit-8(CCK-8)法连续测定细胞吸光度值并绘制细胞生长曲线，检测过表达miRNA-520a-3p或沉默miRNA-520a-3p对GC细胞细胞外酸化率(ECAR)、氧消耗率(OCR)、葡萄糖的摄取能力、乳酸产生能力和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成能力的影响。建立GC细胞移植肿瘤瘤模型，观察过表达miRNA-520a-3p对GC细胞在体内增殖的影响。
研究结果：
1.CCK8检测结果显示：与对照组比较，过表miRNA-520a-3p抑制了GC细胞AGS和MKN-28的增殖，而抑制miRNA-520a-3p促进了AGS和MKN-28细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)。
2.ECAR、OCR、葡萄糖、乳酸和ATP检测结果显示：与对照组比较，过表达miRNA-520a-3p抑制了GC细胞AGS和MKN-28的ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成，促进了OCR；而抑制miRNA-520a-3p则促进了GC细胞AGS和MKN-28的ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成，抑制了OCR(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)。
3.GC细胞移植肿瘤模型显示：过表达miRNA-520a-3p显著降低了肿瘤体积和重量，减弱肿瘤对裸鼠体重的影响(P＜0.05或P＜0.01)。
研究结论：
1.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞的增殖。
2.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞的糖酵解。
3.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞体内生长。
第三部分：miRNA-520a-3p抑制胃癌细胞增殖和糖酵解分子机制研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p对GC细胞增殖和糖酵解的分子机制。
研究方法：
利用TargetScan预测miRNA-520a-3p的靶基因为AKT1，通过细胞转染技术向AGS和MKN-28细胞共转染miRNA-520a-3p的模拟物或对照物及AKT1基因3′-UTR野生型或突变体质粒，利用双荧光素酶报告实验检测miRNA-520a-3p对AKT1转录的影响；运用westernblot检测过表达miRNA-520a-3p的AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达。然后向过表达miRNA-520a-3p的AGS和MKN-28细胞中转染过表达AKT1质粒，运用westernblot检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p抑制AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白表达的影响，CCK-8法检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p抑制AGS和MKN-28细胞增殖的影响，同时检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p调节AGS和MKN-28细胞ECAR、OCR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成的影响。
研究结果：
1.双荧光素酶报告实验结果实验结果显示：与对照组比较,miRNA-520a-3p模拟物和AKT1基因3′-UTR野生型质粒共转染AGS和MKN-28细胞显著降低了荧光素酶活性(P＜0.01)；miRNA-520a-3p模拟物和AKT1基因3′-UTR突变型质粒共转染AGS和MKN-28细胞对荧光素酶活性无影响(P＞0.05)。
2.Westernblot检测结果显示：与对照组比较，过表达miRNA-520a-3p显著抑制了AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。
3.Westernblot检测结果显示：与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miR-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达显著上调(P＜0.05或P＜0.01)。
4.CCK8检测结果显示：与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miR-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞增殖能力显著增加(P＜0.05)。
5.与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miRNA-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞中ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成显著增加，OCR显著降低(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001).
研究结论：
1.miRNA-520a-3p结合AKT1并抑制ATK1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达。
2.过表达AKT1减弱了miRNA-520a-3p抑制ATK1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白表达的作用。
3.过表达AKT1减弱了miRNA-520a-3p抑制AGS和MKN-28细胞增殖和糖酵解的作用。证实miR-520a-3p通过ATK1/mTOR/HIF1α信号通路抑制GC细胞增殖和糖酵解。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小型非编码RNA分子，长约18~25个核苷酸，可以结合mRNA的5端、3端或mRNA前体内含子调节mRNA表达，参与肿瘤细胞的增殖、转移和糖酵解。miRNA-520a-3p是miRNA-520家族成员，已被证实在非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和甲状腺乳头状癌中表达下调，并参与这些肿瘤细胞转移和增殖，但是miRNA-520a-3p在GC中的表达及对GC细胞增殖和糖酵解调控分子机制还需进一步探索。
第一部分：miRNA-520a-3p在胃癌细胞和组织中表达研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p在GC组织和细胞中的表达
研究方法：
提取GC组织和细胞的miRNA，利用RT-qPCR检测miRNA-520a-3p表达水平。
研究结果：
1.RT-qPCR检测结果显示：与癌旁正常组织比较，GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著下调；同时Ⅲ、Ⅳ期GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期GC组织(P＜0.01或P＜0.001)。
2.RT-qPCR检测结果显示：与正常胃上皮细胞(GES-1)比较，GC细胞AGS、MKN-28、MKN-45、BGC-823和SGC-7901中miRNA-520a-3p表达水平显著下调(P＜0.001)。
研究结论：
1.在GC组织和细胞中miRNA-520a-3p表达水平显著下调。
2.Ⅲ、Ⅳ期GC组织中miRNA-520a-3p表达水平显著低于Ⅰ、Ⅱ期GC组织。
第二部分：miRNA-520a-3p对胃癌细胞增殖和糖酵解作用研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p对GC细胞增殖和糖酵解的作用。
研究方法：
通过细胞转染技术，向AGS和MKN-28细胞分别转染过表达miRNA-520a-3p慢病毒(LV-miRNA-520a-3p)或对照慢病毒(NC)；此外，向AGS和MKN-28细胞分别转染miRNA-520a-3pinhibitor或对照物(NC)；然后利用CellCountingKit-8(CCK-8)法连续测定细胞吸光度值并绘制细胞生长曲线，检测过表达miRNA-520a-3p或沉默miRNA-520a-3p对GC细胞细胞外酸化率(ECAR)、氧消耗率(OCR)、葡萄糖的摄取能力、乳酸产生能力和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成能力的影响。建立GC细胞移植肿瘤瘤模型，观察过表达miRNA-520a-3p对GC细胞在体内增殖的影响。
研究结果：
1.CCK8检测结果显示：与对照组比较，过表miRNA-520a-3p抑制了GC细胞AGS和MKN-28的增殖，而抑制miRNA-520a-3p促进了AGS和MKN-28细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)。
2.ECAR、OCR、葡萄糖、乳酸和ATP检测结果显示：与对照组比较，过表达miRNA-520a-3p抑制了GC细胞AGS和MKN-28的ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成，促进了OCR；而抑制miRNA-520a-3p则促进了GC细胞AGS和MKN-28的ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成，抑制了OCR(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001)。
3.GC细胞移植肿瘤模型显示：过表达miRNA-520a-3p显著降低了肿瘤体积和重量，减弱肿瘤对裸鼠体重的影响(P＜0.05或P＜0.01)。
研究结论：
1.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞的增殖。
2.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞的糖酵解。
3.miRNA-520a-3p可抑制GC细胞体内生长。
第三部分：miRNA-520a-3p抑制胃癌细胞增殖和糖酵解分子机制研究
研究目的：
探讨miRNA-520a-3p对GC细胞增殖和糖酵解的分子机制。
研究方法：
利用TargetScan预测miRNA-520a-3p的靶基因为AKT1，通过细胞转染技术向AGS和MKN-28细胞共转染miRNA-520a-3p的模拟物或对照物及AKT1基因3′-UTR野生型或突变体质粒，利用双荧光素酶报告实验检测miRNA-520a-3p对AKT1转录的影响；运用westernblot检测过表达miRNA-520a-3p的AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达。然后向过表达miRNA-520a-3p的AGS和MKN-28细胞中转染过表达AKT1质粒，运用westernblot检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p抑制AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白表达的影响，CCK-8法检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p抑制AGS和MKN-28细胞增殖的影响，同时检测过表达AKT1对miRNA-520a-3p调节AGS和MKN-28细胞ECAR、OCR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成的影响。
研究结果：
1.双荧光素酶报告实验结果实验结果显示：与对照组比较,miRNA-520a-3p模拟物和AKT1基因3′-UTR野生型质粒共转染AGS和MKN-28细胞显著降低了荧光素酶活性(P＜0.01)；miRNA-520a-3p模拟物和AKT1基因3′-UTR突变型质粒共转染AGS和MKN-28细胞对荧光素酶活性无影响(P＞0.05)。
2.Westernblot检测结果显示：与对照组比较，过表达miRNA-520a-3p显著抑制了AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达(P＜0.05或P＜0.01)。
3.Westernblot检测结果显示：与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miR-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞中AKT1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达显著上调(P＜0.05或P＜0.01)。
4.CCK8检测结果显示：与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miR-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞增殖能力显著增加(P＜0.05)。
5.与过表达miRNA-520a-3p组比较，过表达miRNA-520a-3p+AKT1组AGS和MKN-28细胞中ECAR、葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP合成显著增加，OCR显著降低(P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001).
研究结论：
1.miRNA-520a-3p结合AKT1并抑制ATK1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白的表达。
2.过表达AKT1减弱了miRNA-520a-3p抑制ATK1、mTOR、HIF1α、Glut1和VEGF蛋白表达的作用。
3.过表达AKT1减弱了miRNA-520a-3p抑制AGS和MKN-28细胞增殖和糖酵解的作用。证实miR-520a-3p通过ATK1/mTOR/HIF1α信号通路抑制GC细胞增殖和糖酵解。