食管癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位居第六位和第四位，主要病理类型为食管鳞状细胞癌，其特性为侵袭性强，临床进展迅速，预后差，易复发。尽管以外科手术加化疗、放疗等联合治疗，五年存活率仍低于20％，治疗进展缓慢。因此，寻找小分子靶向治疗药物显得尤为迫切。　　Aurora激酶是丝氨酸/酪氨酸蛋白家族的成员，是调控有丝分裂的重要激酶，近年来被作为癌症治疗的热门靶点。Aurora激酶在纺锤体组装、中心体的成熟和分离以及染色体分化等有丝分裂过程中发挥重要作用。Aurora激酶的过表达导致有丝分裂异常，从而使肿瘤更容易发生。在人类的多种肿瘤中都检测到Aurora激酶的过表达。目前报道，Aurora A激酶家族包括三个成员，Aurora A, Aurora B和Aurora C,其功能各不相同。Aurora A激酶位于中心体上，在有丝分裂时Aurora A和纺锤体两级相连并且参与中心体的组装和非中心体的纺锤体组装。Aurora B是染色体乘客复合物的成分，同时磷酸化组蛋白H3上的丝氨酸10从而控制染色质的浓缩。对于Aurora C的报道很少，它在减数分裂中起重要作用，调节精子的形成。研究证实，Aurora激酶在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌及膀胱癌等中恶性肿瘤中都存在过表达，但在食管癌中的作用还没有明确。作为热门的抗癌新靶点，许多制药公司和科研机构致力于Aurora激酶抑制剂的研发。目前，已有大量的关于Aurora激酶小分子抑制剂的报道，但是能够同时抑制有丝分裂重要激酶的Aurora A和Aurora B小分子抑制剂却寥寥无几，且毒副作用较高。因此，筛选高效、低毒且同时抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的抑制剂显得尤为重要，且分子机制的研究为新药的研发提供重要的治疗策略。　　在本研究中，我们通过超级计算机技术，自主研发合成特异性的抑制Aurora A和Aurora B的小分子化合物APIO-EE-9。我们发现此小分子化合物可以抑制食管癌细胞的锚定非依赖性生长和细胞增殖，诱导食管癌细胞的凋亡。通过计算机模拟技术，我们发现此化合物可以同时和Aurora A和Aurora B竞争性的结合在疏水性的ATP口袋从而发挥抑制作用。数据显示，APIO-EE-9处理食管癌细胞可以降低Aurora激酶下游组蛋白 H3丝氨酸10的磷酸化水平。同时，敲除食管癌细胞中Aurora A和Aurora B的表达，可以抑制食管癌细胞的增殖和锚定非依赖性生长。裸鼠移植瘤模型及食管癌人组织来源性肿瘤异种移植（ PDX）模型也证明，APIO-EE-9在没有影响小鼠体重的同时对食管癌肿瘤的生长有明显的抑制作用。　　第一章：APIO-EE-9抑制食管癌细胞的锚定非依赖生长及细胞增殖　　方法：　　1.利用超级计算机技术，自主研发合成Aurora激酶抑制剂APIO-EE-9。　　2.检测APIO-EE-9对正常食管上皮细胞的毒性。　　3.利用软琼脂集落形成实验检测 APIO-EE-9对食管癌细胞锚定非依赖生长性的影响。　　4.MTS法检测APIO-EE-9对食管癌细胞活性的影响。　　结果：　　1.设计合成了能够同时抑制Aurora A和AuroraB激酶活性的化合物APIO-EE-9　　2. APIO-EE-9对正常食管上皮细胞Het-1A无明显的毒性作用　　MTS结果显示表明：不同浓度的APIO-EE-9处理正常食管上皮细胞Het-1A24小时或者48小时，与对照组相比，492nm处吸光度无明显降低，提示此化合物对正常食管上皮细胞没有明显毒性。　　3. APIO-EE-9能够抑制食管癌细胞的锚定非依赖性生长　　软琼脂集落形成实验显示：APIO-EE-9能够呈剂量依赖性的抑制食管癌细胞系KYSE450、KYSE510和KYSE30的克隆形成。0.25μM APIO-EE-9已经显著抑制了食管癌细胞的克隆形成（ p<0.01），抑制效率达到50%以上。5μM APIO-EE-9已经完全抑制了克隆形成。　　4. APIO-EE-9能够抑制食管癌细胞的增殖　　细胞增殖实验结果显示：不同浓度的APIO-EE-9处理食管癌细胞KYSE450、KYSE510和KYSE30后，能够明显抑制其细胞活性。5μM APIO-EE-9处理食管癌细胞72小时后，492nm处吸光度显著降低（p<0.01）。　　第二章：APIO-EE-9诱导食管癌细胞的凋亡　　方法：　　1.流式细胞仪检测 APIO-EE-9对食管癌细胞及正常食管上皮细胞凋亡的影响。　　2.不同浓度的APIO-EE-9处理食管癌细胞，Western blot检测其对凋亡信号的影响。　　结果：　　1.APIO-EE-9诱导食管癌细胞凋亡，但对正常食管上皮细胞没有影响　　流式细胞仪检测结果显示:不同浓度的APIO-EE-9处理正常食管上皮细胞72小时后，相比对照组，5μM APIO-EE-9仅能诱导8.5%的细胞凋亡。而用高浓度的APIO-EE-9(5μM)处理食管癌细胞KYSE45072小时后，结果显示能够诱导83.68%的细胞凋亡，与对照组相比，差异显著(p<0.01)。　　2.APIO-EE-9能够诱导食管癌细胞的凋亡，并且引起凋亡相关信号的改变　　Western blot检测结果显示，不同浓度的APIO-EE-9处理食管癌细胞KYSE450， KYSE510和 KYSE30细胞72小时后，上调促凋亡相关蛋白cleaved-PARP, cleaved caspase3和Bax,下调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2。　　第三章：Aurora A和Aurora B在人食管癌组织和食管癌细胞中高表达　　方法：　　1.Western blot检测Aurora A和Aurora B在不同的食管癌细胞系KYSE450、KYSE510和KYSE30中的表达情况，并且以正常食管上皮细胞Het-1A作为对照。　　2.免疫组化法检测Aurora A和Aurora B在人食管癌组织中的表达情况。　　3.APIO-EE-9处理食管癌细胞24小时后，用Western blot检测其对Aurora下游Histone H3的磷酸化水平的影响。　　4.5μM APIO-EE-9处理食管癌细胞KYSE4502小时后，用免疫荧光的方法检测是否出现多个细胞核。　　结果：　　1.与正常食管上皮细胞相比，Aurora A和Aurora B在食管癌细胞系中高表达　　Westernblot结果显示：与正常的食管上皮细胞Het-1A相比, Aurora A和Aurora B在不同的食管癌细胞系中均呈现高表达状态。　　2.与食管癌癌旁正常组织相比，Aurora A和Aurora B在食管癌组织中高表达　　免疫组化结果显示：相比食管癌癌旁正常组织，Aurora A和Aurora B在人食管癌组织中高表达，且差异显著（p<0.01）。　　3.APIO-EE-9以剂量依赖的方式抑制Aurora下游Histone H3的磷酸化水平　　不同浓度的APIO-EE-9处理食管癌细胞KYSE450、KYSE510和 KYSE3024小时后，Western blot检测Aurora下游Histone H3的磷酸化水平。结果显示：APIO-EE-9能够抑制Histone H3的磷酸化水平，并且呈现剂量依赖的方式。　　4.APIO-EE-9处理食管癌细胞后，荧光显微镜下可以看到多倍体出现高浓度的APIO-EE-9（5μM)）处理食管癌细胞KYSE4502小时以后，在荧光显微镜下可以观察到其一个细胞内有两个或者多个细胞核，而在对照组细胞内却没有此现象。　　第四章：APIO-EE-9在体外结合并抑制Aurora A和Aurora B的活性　　方法：　　1.利用超级计算机技术模拟化合物APIO-EE-9与靶标蛋白Aurora A和Aurora B的相互作用。　　2.体外激酶实验首先用活化的Aurora A或者Aurora B激酶，以Histone H3.3作为底物，在ATP的催化作用下，检测化合物APIO-EE-9对Aurora A和Aurora B激酶活性的影响。　　3.Aurora A或者Aurora B蛋白激酶ATP竞争抑制实验。　　4.化合物APIO-EE-9蛋白下拉实验。　　结果：　　1.APIO-EE-9与Aurora A或者Aurora B蛋白的ATP结合区域相结合　　超级计算机模拟实验证明：小分子化合物APIO-EE-9与Aurora A或者Aurora B的ATP结合口袋存在相互作用，能与这一结构结合形成复合物。　　2.APIO-EE-9体外抑制Aurora A或者Aurora B激酶活性　　体外激酶实验结果显示：APIO-EE-9对Aurora A或者Aurora B激酶活性抑制效果显著。这一结果说明，APIO-EE-9确实能能够抑制了Aurora A或者Aurora B激酶活性。　　3.APIO-EE-9与Aurora A或者Aurora B蛋白激酶的ATP结合区域相互结合，同时竞争性的抑制ATP与Aurora A或者Aurora B的结合　　结果显示：小分子化合物APIO-EE-9作用于Aurora A或Aurora B的ATP结合口袋，并剂量依赖性竞争抑制ATP与Aurora A或者Aurora B的结合。　　4.APIO-EE-9与Aurora A或者Aurora B蛋白在细胞水平结合　　Pull down实验证明：小分子化合物APIO-EE-9能与Aurora A或者Aurora B相互作用，形成复合物。　　第五章：下调Aurora A的表达能够抑制食管癌细胞的克隆形成和细胞增殖，同时促进食管癌细胞的凋亡　　方法：　　1.利用针对Aurora A的shRNA,包装出逆转录病毒，感染食管癌细胞KYSE450和KYSE510，从而下调Aurora A的表达。Western Blot检测不同的shRNA对Aurora A下调的效果，以?-actin作为上样对照。　　2.软琼脂集落形成实验检测下调Aurora A的表达后对食管癌细胞克隆形成的影响。　　3.MTS检测下调Aurora A的表达后，对食管癌细胞增殖能力的影响。　　4.流式细胞仪检测下调Aurora A的表达后，对食管癌细胞凋亡的影响。　　5.Western Blot检测下调Aurora A的表达后,对食管癌细胞凋亡相关蛋白以及Aurora下游Histone H3磷酸化水平的影响。　　结果：　　1.用shAurora A＃1和shAurora A＃2包装的逆转录病毒成功下调食管癌细胞KYSE450和KYSE510中的Aurora A表达　　Western Blot结果显示：用shAurora A＃1和shAurora A＃2包装的逆转录病毒感染KYSE450和KYSE510细胞系，Aurora A的表达水平与对照组相比明显下降，以?-actin作为上样对照。　　2.shAurora AKYSE450和KYSE510细胞组克隆形成数明显少于shmockKYSE450和KYSE510细胞组　　软琼脂集落形成实验结果显示：下调Aurora A的表达后，shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组能够明显抑制食管癌细胞KYSE450和KYSE510的锚定非依赖性生长，跟shmock细胞组相比，克隆数目明显减少（p<0.01）。　　3.下调Aurora A的表达水平，能够明显抑制食管癌细胞的增殖能力　　MTS结果显示：下调Aurora A的表达后，shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组能够显著抑制试管癌KYSE450和KYSE510的增殖（p<0.01）　　4.下调Aurora A的表达水平，能够明显促进食管癌细胞的凋亡　　流式细胞仪检测结果显示：下调Aurora A的表达水平后，shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组分别能够引起KYSE450细胞系18%和10%的细胞凋亡，而引起shMock的细胞凋亡只有1%（p<0.01）；shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组分别能够引起KYSE510细胞系9%和12%的细胞凋亡，而引起shMock的细胞凋亡只有2%（p<0.01）。　　5.下调Aurora A的表达水平，显著增加了凋亡相关信号cleaved PARP, cleaved caspase3及Bax的表达水平，同时显著抑制了Aurora下游信号分子Histone H3的磷酸化水平　　Western Blot结果显示：与shMock细胞组相比，shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组分别在 KYSE450和 KYSE510细胞系中显著增加了促凋亡相关蛋白cleaved PARP,cleavedcaspase3以及BAX的表达水平。同时，下调Aurora A的表达水平后，显著抑制了Aurora下游信号分子Histone H3的磷酸化水平。　　第六章：下调Aurora B的表达能够抑制食管癌细胞的克隆形成和细胞增殖，同时促进食管癌细胞的凋亡　　方法：　　1.利用针对Aurora B的shRNA,包装出逆转录病毒，感染食管癌细胞KYSE450和KYSE510，从而下调Aurora B的表达。Western Blot检测不同的shRNA对Aurora B下调的效果，以?-actin作为上样对照。　　2.软琼脂集落形成实验检测下调Aurora B的表达后对食管癌细胞克隆形成的影响。　　3.MTS检测下调Aurora B的表达后，对食管癌细胞增殖能力的影响。　　4.流式细胞仪检测下调Aurora B的表达后，对食管癌细胞凋亡的影响。　　5.Western Blot检测下调Aurora B的表达后,对食管癌细胞凋亡相关蛋白以及Aurora下游Histone H3磷酸化水平的影响。　　结果：　　1.用shAurora B＃1和shAurora B＃2包装的逆转录病毒成功下调食管癌细胞KYSE450和KYSE510中的Aurora B表达　　Western Blot结果显示：用shAurora B＃1和shAurora B＃2包装的逆转录病毒感染KYSE450和KYSE510细胞系，Aurora B的表达水平与对照组相比明显下降，以?-actin作为上样对照。　　2.shAurora BKYSE450和KYSE510细胞组克隆形成数明显少于shmockKYSE450和KYSE510细胞组　　软琼脂集落形成实验结果显示：下调Aurora B的表达后，shAurora B＃1和shAurora B＃2细胞组能够明显抑制食管癌细胞KYSE450和KYSE510的锚定非依赖性生长，跟shmock细胞组相比，克隆数目明显减少（p<0.01）。　　3.下调Aurora B的表达水平，能够明显抑制食管癌细胞的增殖能力　　MTS结果显示：下调Aurora B的表达后，shAurora B＃1和shAurora B＃2细胞组能够显著抑制试管癌KYSE450和KYSE510的增殖（p<0.01）　　4.下调Aurora B的表达水平，能够明显促进食管癌细胞的凋亡　　流式细胞仪检测结果显示：下调Aurora B的表达水平后，shAurora B＃1和shAurora B＃2细胞组分别能够引起KYSE450细胞系88%和85%的细胞凋亡，而引起shMock的细胞凋亡只有16%（p<0.01）；shAurora A＃1和shAurora A＃2细胞组分别能够引起KYSE510细胞系22%和15%的细胞凋亡，而引起shMock的细胞凋亡只有6%（p<0.01）。　　5.下调AuroraB的表达水平，显著增加了凋亡相关信号cleaved PARP, cleaved caspase3及Bax的表达水平，同时显著抑制了Aurora下游信号分子Histone H3的磷酸化水平　　Western Blot结果显示：与shMock细胞组相比，shAuroraB＃1和shAuroraB＃2细胞组分别在 KYSE450和 KYSE510细胞系中显著增加了促凋亡相关蛋白cleaved PARP和cleavedcaspase表达水平。同时，下调Aurora B的表达水平后，显著抑制了Aurora下游信号分子Histone H3的磷酸化水平以及抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。　　第七章：下调AuroraA和AuroraB的表达水平，显著抑制了食管癌细胞体内肿瘤生长　　方法：　　1.利用下调Aurora A或者Aurora B的食管癌细胞株KYSE450裸鼠移植瘤模型检测下调Aurora A和Aurora B的表达水平后对肿瘤生长抑制的作用。　　2.免疫组织化学检测下调Aurora A和Aurora B的表达水平后对裸鼠异种移植瘤肿瘤组织Histone H3的磷酸化水平，凋亡相关标志BAX及增殖标志Ki-67水平的影响。　　结果：　　1.下调Aurora A和Aurora B的表达水平后,显著抑制了细胞株KYSE450裸鼠移植瘤生长　　裸鼠移植瘤动物模型结果显示：下调Aurora A和Aurora B的表达水平后，肿瘤的体积随着天数的增长明显受到抑制，且差异显著（p<0.01）。　　2.下调Aurora A和Aurora B的表达水平后，抑制了Histone H3的磷酸化水平及增殖指标Ki-67，促进了凋亡相关标志BAX的增多　　免疫组织化学结果显示：与shMock组相比较，下调Aurora A和Aurora B的表达水平后，增殖标志Ki-67表达水平显著降低（p<0.01）；Aurora下游信号分子Histone H3的磷酸化水平受到显著抑制（p<0.01），同时，凋亡标志BAX显著增多（p<0.01）。此实验结果说明Aurora A和Aurora B在肿瘤的发生中起着重要的作用，下调其水平就可以抑制肿瘤的发生。　　第八章：APIO-EE-9抑制食管癌人组织来源的移植瘤生长　　方法：　　1.通过人源性肿瘤组织异体移植模型（ PDX）验证APIO-EE-9对食管癌组织的生长抑制作用。　　2.免疫组织化学检测 PDX模型中肿瘤组织的相关蛋白表达情况。　　结果：　　1.在PDX模型中，APIO-EE-9能够显著抑制食管癌组织质量和体积的增长　　PDX动物实验结果显示：荷瘤小鼠随着APIO-EE-9给药时间增长，肿瘤体积明显小于安慰剂对照组（p<0.05）,且小鼠的体重并没有随着APIO-EE-9的给药而明显降低。给药6周以后我们发现，低剂量组（40mg/kg）即能够明显降低肿瘤质量和肿瘤体积（ p<0.05），APO-EE-9高剂量组（200mg/kg）对肿瘤生长抑制与低剂量组无明显差异。　　2.APIO-EE-9体内抑制增殖指标Ki-67，且抑制Histone H3的磷酸化　　免疫组织化学结果显示：与对照组相比较，APIO-EE-9治疗后的肿瘤组织中， Ki-67,p-Histone H3的表达水平均受到抑制，cleaved caspase3的表达水平增高，与对照组相比差异明显（p<0.01）。　　结论：　　1.APIO-EE-9作为本实验室自主研发合成的新型化合物，通过计算机模拟、体外水平、细胞水平以及体内水平的研究结果证实：APIO-EE-9直接作用于Aurora的ATP结合区域上，与Aurora结合，并通过ATP竞争的方式抑制其异常激活，继而抑制其下游信号转导通路，最终抑制食管癌细胞的生长和增殖。　　2.食管癌细胞株移植瘤及食管癌人组织来源的移植瘤模型结果与细胞水平实验结果相一致。APIO-EE-9能够有效抑制食管癌细胞的生长和增殖，且无明显毒副作用。这为食管癌的分子靶向治疗提供了新的治疗选择。