肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种神经系统变性疾病,以大脑皮层、脑干及脊髓前角运动神经元选择性丢失为特征,表现为肌无力、肌肉萎缩、肌束震颤及锥体束征。家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)中20%与Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)突变有关,表达人突变SOD1基因的小鼠临床及病理表现与人ALS相似。自1991年Siddique等将ALS的连锁位点定于21号染色体后,相继多个研究证ALS中存在SOD1基因突变,突变位点几乎跨越整个SOD1分子。大多为错义突变,引起表达蛋白中某个氨基酸的替换；少数为非错义突变—早期终止突变,产生翻译后蛋白分子的一段序列缺失。错义突变中以外显子中密码子4位丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)即A4V突变,为最常见的突变位点。考虑到SOD1突变体(mutant SOD 1,mSOD1)活性显著下降,最初认为,mSOD1引起ALS的可能机制是mSOD1酶活性降低,导致自由基清除障碍,继发氧化损伤运动神经元(motor neuronMN)。后续研究发现部分mSOD1保持一定甚至全部的酶活性。过表达野生型SOD1 (wtSOD1)并不会减轻甚至恶化转基因小鼠ALS症状,同时敲除SOD1小鼠并没有出现明显的ALS病状,推测ALS可能与mSOD1“获得毒性功能”有关。目前已创建了多种表达人SOD1 (hSOD1)突变的转基因鼠模型,其中hSOD1G93A转基因小鼠应用最广泛,是目前国际上公认的ALS发病机制及临床前药物研究的动物模型。最近研究表明ALS的大脑皮层、脑干及脊髓前角运动神经元选择性丢失大多数是由凋亡引起的。目前已知有三条主要的细胞内信号转导通路来调控细胞凋亡：(1)线粒体通路；(2)死亡受体通路；(3)内质网通路。内质网应激激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response UPR),UPR是由一个内质网分子伴侣GRP78/BIP和三个内质网应激感受蛋白所介导的,三个感受蛋白分别是PERK (PKR-like ER kinase), ATF6 (activating transcription factor 6)和IRE-1 (inositol-requiring enzyme 1),当发生内质网应激时引起GRP78/BIP与三个感受蛋白PREK. AFT6和IRE-1的分离,进而激活PREK、ATF6和IRE-1三条信号通路。ATF6是内质网膜上的Ⅱ型跨膜蛋白。当发生内质网应激时,ATF6与GRP78解离后转移到高尔基体,由高尔基体蛋白酶S1P及S2P对其跨膜片段进行切割产生游离的50kuN片段(P50),P50进入细胞核进而引起CHOP、GRP78和ERAD蛋白的表达。进而引起细胞的凋亡。最近研究表明在hSOD1G93A小鼠的脊髓中存在内质网应激和内质网应激引起的细胞凋亡。本文初步研究hSOD1G93A小鼠的大脑运动皮层中也存在内质网应激中ATF6信号通路的激活。第一部分hSOD1G93A转基因小鼠的繁殖和鉴定目的：获取hSOD1G93A转基因小鼠。方法：以B6SJL-Tg (SOD1-G93A) 1Gur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J+／+雌鼠配种,提取尾尖的DNA,进行PCR分析鉴定。结果：鉴定出含hSOD1G93A转基因的小鼠和含wtSOD1基因的小鼠。结论：hSOD1G93A转基因的小鼠作为FALS的动物模型进行实验研究,含wtSOD1基因的小鼠作为实验对照组。第二部分hSOD1G93A转基因小鼠的大脑运动皮层中内质网应激因子ATF6的变化目的：观察hSOD1G93A转基因小鼠的大脑运动皮层中内质网应激因子ATF6的变化,揭示内质网应激在ALS病理机制中的作用。方法：1实验分组分四组：分别为含wtSOD1基因小鼠的对照组3只(120天)、症状前期hSOD1G93A转基因小鼠3只(60天)、症状早期hSOD1G93A转基因小鼠3只(100-120天)、终末期hSOD1G93A转基因小鼠3只(120-130天)。2取材用1O%的水合氯醛麻醉小鼠,4%的多聚甲醛心脏内灌注固定后,取出大脑,分出运动皮层区域,浸泡在4%的多聚甲醛中,震动切片机连续切片,片厚30μm。3免疫组化震动切片0.01MPBS洗三次,各5分钟,10% H2O2室温中15分钟,0.01MTBS洗三次,各5分钟,10%马血清封闭1小时,加入1：200 ATF6兔多克隆抗体,4℃孵育摇床过夜；加入1：200生物素化山羊抗兔IgG常温摇床2 h；加入1：200辣根酶标记链霉卵白素常温摇床1h；DAB显色,终止显色,铺片、常规脱水、封片。4统计分析实验结果以均值±标准差(x±s)表示,采用SAS V8.0软件进行统计分析,组间比较采用方差分析,统计结果以P<0.05为有显著差异。结果：对照组ATF6多位于细胞的胞浆中。ATF6进入细胞核的MN的数量症状前期较对照组明显增多具有统计学意义,症状早期和终末期较对照组和症状前期明显增多具有统计学意义,症状期和终末期相比无明显改变。症状早期和终末期的一些细胞形态发生改变,出现皱缩。结论：在发病前期(60天)时就存在内质网应激因子ATF6的改变,并随着疾病的进展而加重。说明内质网应激参与了ALS的发病。