背景甲状腺癌(Thyroid cancer)是临床上最常见的内分泌恶性肿瘤,包括分化良好的甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC),占甲状腺癌发病率的80%～90%。疑似甲状腺结节的患者通常通过超声,计算机断层扫描(CT)等进行检查,随后经术前超声引导细针穿刺细胞学检查(fine needle aspiration cytology,FNAC)和术中病理检查冷冻切片检查诊断甲状腺乳头状癌患者。FNAC是目前术前最可靠的临床诊断方法,但是有约20%左右的甲状腺病理组织经FNAC诊断为未确定意义的非典型性的滤泡性病变、滤泡性肿瘤或疑似滤泡性肿瘤、或疑似的恶性肿瘤。无法进行术前的准确诊断造成了非要手术的增加,研究发现,5%的病人经手术切除组织后,诊断发现仍然需要进行二次甲状腺全切手术,而且两次手术的复发发病率明显高于FNA检出后的一次手术的发病率。利用分子标记物辅助诊断能够提高肿瘤的检出,CCT3是参与细胞的蛋白质结构的折叠,调控肿瘤细胞的增殖和发展,在肝癌、肺癌等癌症的临床诊断和预后检查中具有重要的实用价值和参考意义。甲状腺乳头状癌的治疗方法主要为甲状腺全切除术(或次全切除术)、甲状腺腺叶+峡部切除术以及术后以放射性碘/内分泌抑制药物来进行辅助治疗。虽然90%以上的患者经手术和术后治疗得到有效的控制,但仍有5-10%的患者出现转移和复发。MAPK信号通路是驱动甲状腺癌发病和发展的主要通路,该通路的激活依赖于细胞膜表面受体与配体的结合,比如VEGFR、FGFR等。美国FDA批准的用于治疗复发的转移的难治性甲状腺癌的药物有索拉菲尼和Lenvatinib,这两个药物可以同时靶向抑制VEGFR、FGFR、PDGFR、c-Kit及RET/PTCs的酪氨酸激酶抑制剂。多靶点抑制剂也表明这两个药物的不良反应特别强,难治性甲状腺乳头状癌的治疗仍然缺乏有效地特异性强的治疗靶点和方法。抑制CCT3能够抑制肝细胞癌的增殖和发展,而甲状腺癌中的特异性分子靶标少有研究报道。目的研究分析CCT3与甲状腺乳头状癌组织和癌旁组织分布情况和关系,分析CCT3作为甲状腺乳头状癌新的诊断分子标记物的可能性。研究CCT3对甲状腺乳头状癌细胞生物学功能的作用,评价CCT3作为新的治疗靶点的意义和可能性。定性和定量分析了 CCT3与甲状腺乳头状癌的关系,研究探讨CCT3成为辅助诊断术前甲状腺乳头状癌的新的分子标记物的可能性。同时研究CCT3对甲状腺乳头状癌发生发展的作用机制。方法(1)甲状腺乳头癌组织诊断鉴定:收集临床甲状腺乳头状癌病人手术后的癌组织和癌旁组织,样本经固定、切片和HE染色经病理专家确认诊断为甲状腺乳头状癌。(2)甲状腺乳头状癌组织中CCT3表达的检测:经确诊的术后组织切片采用免疫组织化学染色的方法,观察并采用组织分级的方法对样本中CCT3的表达进行定性定量,分析CCT3与甲状腺乳头状癌发病的关系。(3)RNA干扰甲状腺乳头状癌细胞中的CCT3:通过构建RNAi沉默CCT3的shRNA慢病毒载体,利用shRNA慢病毒感染高表达CCT3的甲状腺乳头状癌的细胞。沉默效果经实时定量PCR和Western Blot技术检测。(4)CCT3在细胞中表达量的检测:本研究采用实时定量PCR技术分析两个甲状腺乳头状癌细胞系中CCT3的表达水平。选择CCT3表达水平较高的细胞作为研究工具,通过构建RNAi沉默CCT3的表达载体,在高表达CCT3的甲状腺乳头状癌细胞系中沉默CCT3,研究CCT3对甲状腺乳头状癌细胞的细胞生物学的作用。(5)细胞增殖能力的检测:本研究采用Celigo仪器对培养的细胞进行计数统计,同时采用MTT法检测细胞的活力,来检测沉默CCT3对甲状腺乳头状癌细胞增殖能力和活力的影响。(6)细胞周期的检测:本研究采用流式细胞技术和核染色来检测沉默CCT3的甲状腺乳头状癌细胞和对照组细胞的各个细胞周期的细胞比率,来研究沉默CCT3对细胞周期的影响。(7)细胞凋亡的检测:本研究利用细胞凋亡试剂AnnexinV对凋亡细胞进行染色,采用流式细胞技术检测沉默CCT3的甲状腺乳头状癌细胞的凋亡的影响。结果本研究对临床甲状腺乳头状癌术后组织进行确诊,同时检测CCT3在癌组织中的分布。然后通过沉默CCT3研究其对甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力、细胞周期和细胞凋亡的影响,研究结果如下:(1)临床术后的甲状腺乳头状癌组织均高表达CCT3,而癌旁组织几乎不表达,且CCT3表达分布于细胞核和细胞质,而相对细胞核分布更多。癌组织的CCT3的表达水平与癌旁组织的表达水平存在显著性差异,通过组织分级打分的方法定量发现,癌组织的CCT3表达水平明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义。(2)CCT3在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中普遍高表达,表明CCT3对临床诊断甲状腺乳头状癌具有重要的参考意义。(3)采用shRNA慢病毒载体沉默甲状腺乳头状癌细胞中CCT3,经实时定量PCR和Western Blot分别检测CCT3的mRNA表达水平和蛋白表达水平结果显示,癌细胞中的CCT3被显著的沉默。(4)沉默甲状腺乳头状癌细胞中高表达的CCT3,与沉默的对照组相比,显著抑制了甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力和活力,表明CCT3与甲状腺乳头状癌细胞增殖相关;(5)沉默CCT3的可以减少甲状腺乳头状癌细胞G1和S期的细胞比率,将细胞周期阻滞于G2/M期,表明CCT3参与促进甲状腺乳头状癌细胞周期的正常进展;(6)抑制CCT3的表达能够诱导甲状腺乳头状癌细胞的凋亡,表明CCT3对甲状腺乳头状癌的存活具有重要作用。结论甲状腺乳头状癌组织高表达伴侣蛋白CCT3,细胞核和细胞质CCT3均有分布,而且细胞核表达相对较高,有可能成为临床诊断甲状腺乳头状癌的一个分子标记物;CCT3普遍表达于甲状腺乳头状癌细胞系中,且促进调控甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力;沉默CCT3阻滞甲状腺乳头状癌细胞周期于G2/M期,表明CCT3参与细胞周期G2/M期的调节和进展;CCT3对甲状腺乳头状癌的细胞凋亡有一定的保护作用。CCT3有希望成为临床上诊断和治疗甲状腺乳头状癌的一个新的指标和靶点。