生殖道感染是引起男性不育及女性不孕的最重要原因之一,而感染能启动固有免疫应答。Toll样受体(TLR)作为固有免疫系统的重要分子,在固有免疫系统抵抗外界干扰方面发挥着重要作用。近年的研究发现TLR表达于作为生殖细胞的精子中,而精子运动被认为是成功受孕的关键。为了探索TLR信号对精子生物学功能的影响,我们首先观察了不同TLR激动剂对精子运动的影响,发现TLR激动剂能够显著抑制精子运动。本课题拟深入研究TLR信号影响精子运动的具体信号通路,并在此基础上进一步探究TLR信号通过影响精子的何种生物学过程最终导致了精子运动减慢。研究内容分为3个部分：1.不同种类的TLR激动剂对精子生物学性能的影响目的：观察不同病原组分的TLR激动剂对小鼠精子运动的影响,并初步探讨TLR激动剂抑制精子运动的可能原因。方法：采用逆转录PCR的方法分析不同TLR在精子中的表达。利用计算机辅助精子分析(CASA)的方法观察不同TLR激动剂与小鼠精子孵育6h后的精子运动情况以及TLR激动剂处理不同时间对正常人精子运动的影响。利用流式细胞术的方法观察TLR激动剂处理6h后的小鼠精子凋亡情况。结果：除了TLR3表达量极低之外,其它的TLR在精子中均有表达。在TLR激动剂处理小鼠精子6h后,除了TLR3所对应的激动剂poly(I：C)对精子运动没有影响,其他TLR激动剂均能不同程度地抑制精子运动。另外,TLR激动剂抑制精子运动具有时间依赖性,Zymosan与LPS均只能在处理6h后才有效抑制精子运动,而R848在作用精子2h后即有抑制效应。与对照组相比,TLR激动剂在6h之内不能有效地促进精子凋亡的发生。结论：TLR激动剂能够有效抑制精子运动并且该效应并不由TLR激动剂促进精子凋亡引起的。2.TLR信号影响精子运动的通路研究目的：探索TLR信号影响精子运动的确切信号通路方法：利用MyD88敲除小鼠研究TLR激动剂对该种小鼠精子运动的影响。使用LPS处理小鼠精子2h,4h,6h,提取蛋白,通过Western-blotting观察小鼠精子IRAK, PI3K, GSK3α, AKT, GSK3β, ERK, p65等分子磷酸化水平的变化,同时使用IRAK, PI3K,MEK/ERK, NF-κB等分子的抑制剂处理小鼠精子半小时后再给予TLR激动剂刺激,CASA观察信号通路被抑制精子运动的改变。使用PI3K抑制剂处理小鼠精子,Western-Blotting观察AKT及GSK3a磷酸化水平的变化。结果：TLR激动剂对MyD88敲除小鼠的精子运动无影响。TLR激动剂处理小鼠精子后可观察到IRAK, PI3K, GSK3a等分子磷酸化水平随处理时间的延长而上升,而AKT,GSK3β, ERK, p65等分子的磷酸化水平无明显变化。IRAK或PI3K通路被抑制后TLR激动剂不再能够显著抑制精子运动,而MEK/ERK, NF-κB通路被抑制后TLR激动剂依然能显著抑制精子运动。PI3K抑制剂处理小鼠精子后,AKT的磷酸化水平没有显著改变而GSK3α的磷酸化水平受到了显著地抑制。结论：TLR信号以MyD88/IRAK4/PI3K及GSK3a依赖而非AKT依赖的信号通路途径抑制精子运动。3.TLR信号影响精子的生物学过程研究目的：探讨TLR信号通过影响精子的何种生物学过程最终抑制了精子运动,并将深入分析TLR信号通路在影响该生物学过程中的作用。方法：利用荧光素酶反应的方法检测TLR激动剂处理6h后小鼠精子ATP水平的变化,进而使用基因敲除小鼠分析TLR激动剂引起的精子ATP水平的变化是否依赖MyD88及PI3K。采用F1F。ATPase ELISA检测试剂盒检测TLR激动剂处理6h后正常人精子F1F。ATPase的活性变化。利用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒通过流式细胞术检测TLR激动剂处理不同时间对小鼠精子膜电位的影响,并利用Western-blotting分析相关信号通路分子在TLR激动剂处理后转移到线粒体的情况。结果：与对照组相比,TLR激动剂处理后显著降低了小鼠精子ATP水平,并且TLR激动剂不能引起MyD88-/-及pik3cd-/-小鼠精子ATP水平的变化。TLR激动剂处理6h后能够引起正常人精子F1F。ATPase活性的显著上升,并以时间依赖的方式降低小鼠精子线粒体膜电位。最后,TLR激动剂处理6h后能够引起PI3K及GSK3a等信号通路分子转移到小鼠精子线粒体中。结论：TLR信号通过影响线粒体膜电位的方式间接消耗ATP从而影响精子运动,该影响依赖于MyD88及PI3K通路。