乳腺癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤,其发病率逐年上升,并呈现出年轻化趋势。乳腺癌患者死亡的首要原因是乳腺癌转移和治疗的失败。因此明确乳腺癌的转移机制,对于乳腺癌的防治具有非常重要的意义。肿瘤微环境对肿瘤的转移起到非常重要的作用。肿瘤细胞与正常细胞相比,通过糖酵解途径消耗更多的葡萄糖并产生少量的ATP和大量的乳酸,肿瘤的这种特征被称为“瓦博格效应”(Warburg effect)。乳酸堆积会造成肿瘤微环境的酸化。有报道显示,乳酸作为肿瘤微环境里的一种化学信号,乳酸的含量和远距离转移的发生率之间存在着正相关关系。丝氨酸/苏氨酸激酶AKT,可通过对基因表达和酶活性的调节,充分诱导肿瘤细胞中的Warburg效应,促进糖酵解和乳酸的生成。非肌细胞肌球蛋白II(Nonmuscle Myosin II,NM II)是细胞骨架的重要组成成分。作为分子马达蛋白家族中的一员,它不仅为细胞的运动提供动力,还参与细胞的各种生理活动,如细胞迁移与粘附、胞质分裂、囊泡分泌等。NM II是一个六聚体的结构,由重链(NMHC)和轻链(NMLC)组成的,其中NMLC对NMHC起着稳定和调节作用,NMHC通过磷酸化活化调控细胞的运动。根据重链不同,NMHCⅡ可分为NMHCⅡA,NMHCⅡB和NMHCⅡC三种亚型。我们课题组前期工作表明,在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7细胞中,均存在NMHCⅡA和NMHCⅡB两个亚型,这两种亚型在乳腺癌细胞的迁移、侵袭等起始阶段,均起着重要的调控作用,且NMHCⅡA影响NMHCⅡB的表达。而乳酸对肿瘤细胞侵袭和转移的调控是否与NMHCIIA有关,尚未见报道。综上,我们认为AKT可以促进乳酸生成,乳酸的含量和远距离转移有关,而这种转移作用极可能与参与肿瘤迁移、侵袭等起始阶段的NMHCIIA有一定关系。目的:从细胞代谢与细胞骨架二者相结合的角度进行分析,以乳腺癌为研究对象,对乳酸和NMHCIIA进行检测,并通过抑制AKT影响乳酸代谢,进而观察降低乳酸含量对肿瘤生物学行为的影响,来综合分析乳酸含量变化调控肌球蛋白重链而引起乳腺癌细胞的侵袭过程。方法:1、通过免疫组织化学方法观察分析乳腺增生组织、乳腺纤维腺瘤组织和乳腺浸润性导管癌组织中AKT、乳酸的关键酶乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)的表达情况,并分析它们与NMHCIIA(NMHCIIA前期已经完成)可能的关系。2、在乳腺癌MCF-7细胞中,通过抑制AKT来降低乳酸含量,从而观察酸性环境对NMHCIIA的调节作用及对MCF-7细胞生物学行为的影响。以MCF-7细胞和敲除NMHCIIA的MCF-7细胞(前期工作已经获得并验证)为研究对象,予以AKT抑制剂MK2206处理,并以AKT抑制剂的溶解剂DMSO处理的细胞作为对照,具体分组如下:AKT抑制剂的溶解剂DMSO处理MCF-7细胞组(DMSO组),AKT抑制剂MK2206处理MCF-7细胞组(AKTi组),AKT溶解剂DMSO处理敲除NMHCIIA的MCF-7细胞组(KD-IIA-DMSO组)和AKT抑制剂MK2206处理敲除NMHCIIA的MCF-7细胞组(KD-IIA-AKTi组)。而后检测它们乳酸、NMHCIIA的表达情况,并观察上述分子的表达差异对乳腺癌细胞生物学活性的影响。(1)分别对MCF-7细胞和敲除NMHCIIA的KD-IIA-DMSO组细胞给予AKT抑制剂MK2206处理后,通过Western Blot检测AKT活化形式p AKT的表达。(2)通过乳酸试剂盒检测各组细胞MK2206处理后乳酸含量的变化。(3)通过Western Blot检测各组细胞MK2206处理后NMHCIIA的表达情况。(4)各组细胞经MK2206处理后生物学行为的变化。(1)应用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化。(2)通过流式细胞术检测细胞周期的改变。(3)通过细胞铺展实验检测细胞铺展面积的改变。(4)采用细胞的划痕实验来分析,细胞迁移能力的变化。(5)采用Transwell侵袭实验来检测细胞侵袭力的变化。结果:1、免疫组织化学染色结果表明,AKT和LDH在乳腺癌中的表达均明显高于它们在乳腺增生组织和乳腺纤维腺瘤组织的表达,在乳腺纤维腺瘤中的表达亦高于乳腺增生组织的表达,均具有统计学意义(P<0.05)。在三种组织中AKT、LDH的表达情况与NMHCIIA表达情况相一致。2、在乳腺癌MCF-7细胞中,通过抑制AKT来降低乳酸含量,从而观察酸性环境对NMHCIIA的调节作用及MCF-7细胞生物学行为的影响。(1)Western Blot结果显示,加入AKT抑制剂MK2206后,AKTi组和KD-IIA-AKTi组细胞的p AKT含量明显降低(P<0.05)。(2)乳酸试剂盒检测培养液中乳酸含量结果显示,与DMSO组细胞相比,KD-IIA-DMSO组和加入MK2206处理的AKTi组和KD-IIA-AKTi组乳酸含量均下调,差异有统计学意义(P<0.05)。但单纯沉默NMHCIIA的KD-IIA组细胞与加入AKT抑制剂MK2206后的AKTi组和KD-IIA-AKTi组细胞相比,乳酸的表达水平无明显差异(P>0.05)。(3)Western Blot结果显示,与DMSO组细胞相比,AKTi组、KD-IIA-AKTi组以及KD-IIA-DMSO组细胞的NMHC II A表达均下调,差异有统计学意义(P<0.05)。但抑制AKT的MCF-7细胞(AKTi组)NMHC II A水平高于敲除NMHCIIA的MCF-7细胞(KD-IIA-AKTi组和KD-IIA-DMSO组细胞)(P<0.05)。(4)各组细胞经MK2206处理后生物学行为的变化。①CCK-8试剂盒检测结果显示,与DMSO组细胞相比,AKTi组、KD-IIA-AKTi组以及KD-IIA-DMSO组细胞的增殖能力均有减弱。②流式细胞术检测细胞周期的结果显示,各组细胞细胞周期没有变化。③细胞铺展实验结果显示,与DMSO组细胞相比,AKTi组、KD-IIA-AKTi组以及KD-IIA-DMSO组细胞的铺展面积明显减小(P<0.05)。④细胞划痕实验结果显示,与DMSO组细胞相比,AKTi组、KD-IIA-AKTi组以及KD-IIA-DMSO组细胞的迁移能力减弱(P<0.05)。⑤Transwell体外侵袭实验结果显示,与DMSO组细胞相比,AKTi组、KD-IIA-AKTi组以及KD-IIA-DMSO组细胞的穿过人工基底膜的细胞数目明显减少,并且差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.乳腺癌组织中,AKT与乳酸脱氢酶在乳腺癌组织中表达明显高于它们在乳腺增生组织和乳腺纤维腺瘤组织的表达,这与NMHCIIA表达相一致。2.乳腺癌细胞中,通过抑制AKT可以降低乳酸含量,并可以抑制NMHCIIA的表达,同时,单纯沉默NMHCIIA细胞中乳酸的表达水平亦有明显降低,说明乳酸与NMHCIIA之间可能存在关联。3.在乳腺癌细胞中,抑制AKT可以调控乳腺癌细胞的生长、铺展、迁移和侵袭,这可能与降低肿瘤微环境中乳酸含量,从而抑制NMHCIIA有关。