肥胖问题一直是困扰人们的世界性健康问题,由肥胖引起的高血脂、高血压、糖尿病、脂肪肝等疾病,对人体危害巨大,已成为威胁人类健康的第二大因素。肥胖问题同时还是一个社会经济问题,每年因肥胖问题造成的社会经济损失巨大,远超过吸烟、酗酒问题。因此,如何有效的防治肥胖及肥胖相关疾病已成为各国亟待解决的热点问题。然而,目前对于肥胖形成及肥胖诱发相关疾病的机制尚有许多不清楚的地方,如何有效的防治肥胖及肥胖相关疾病仍然是个难以解决的问题。在肥胖问题研究中,人们发现三酰甘油(Triacylglycerols,TAG)的合成与动员失调是诱发肥胖的主因。三酰甘油是细胞内含量最多的脂类,也是动植物细胞脂肪贮存的主要形式,三酰甘油失调引起的脂肪酸过剩会导致过多的脂肪酸在皮下、肝脏等组织堆积,引发脂毒,形成肥胖。而脂毒则是引发心血管疾病、脂肪肝、糖尿病等肥胖相关疾病的重要原因,如过剩的脂肪酸在肝脏中堆积无法及时运出时会诱发肥胖型脂肪肝。肥胖及脂毒的产生总是伴随着三酰甘油的升高,肥胖问题与三酰甘油代谢调控的失常密切相关,抑制三酰甘油合成已成为一种治疗肥胖及肥胖相关疾病的重要手段之一。相关降脂药物多以三酰甘油合成通路作为靶点,磷脂磷酸酶(Phosphatidate phosphatase,PAP)所介导的三酰甘油合成通路一直被认为是三酰甘油合成的唯一通路,以现有三酰甘油合成通路的降脂药物研发,选择单一,相关降脂药物研制缓慢,且易引起较大的毒副作用。如PAP活性抑制剂瘦肉精(克伦特罗)和普萘洛尔容易引起头痛、心悸等,危害人体健康。传统抗菌中药黄连素(Berberine,BBR)具有良好的降脂、降TAG活性,且毒副作用小,是治疗肥胖及肥胖相关疾病的绝佳候选化合物。然而黄连素降脂作用与抗菌活性互相交错,导致黄连素降脂机制难以揭示,在临床上无法被大量用作降脂、降糖药物来治疗肥胖及肥胖相关疾病。为了促进肥胖及肥胖相关疾病的防治及研究,系统性的解决以上问题,本论文利用模式生物酿酒酵母在基因功能及脂代谢调控中的独特优势对三酰甘油合成及相关降脂化合物黄连素降脂机制展开了研究,本论文的研究内容主要包括以下四个部分:部分一:三酰甘油合成在缓解脂质毒性(脂毒)中的重要作用。脂毒是肥胖相关疾病产生的重要原因,脂毒的产生往往伴随着脂肪酸代谢平衡的失调。三酰甘油合成通路作为脂肪酸代谢网络中的重要一环,有着显著的脂毒胁迫缓解作用。然而目前对于该通路的脂毒缓解机制并不清楚。为此,我们利用油酸,对三酰甘油合成通路缓解脂毒胁迫的机制进行了研究,通过在三酰甘油缺陷背景下进行的油酸耐受基因筛选,筛选到大量与蛋白质折叠密切相关的耐受基因:ZIM17、ALG2等。更重要的是,通过GRP78表达及新型UPR检测系统检测,发现1m M油酸具有显著的内质网胁迫及UPR激活作用,且胁迫作用强于1m M三酰甘油。而细胞在应对油酸脂毒胁迫时能够显著提高三酰甘油的合成。该结果表明,油酸可能通过影响蛋白质折叠,引起内质网胁迫;三酰甘油合成通路是细胞应对油酸脂毒胁迫的重要环节;细胞在遭受油酸脂毒胁迫时,能够通过促进三酰甘油合成来缓解油酸造成的脂毒胁迫。在该部分研究过程中,我们还发现,在PAH1缺陷情况下,细胞依然能够通过其他途径将油酸转变成三酰甘油,表明细胞内可能存在其他未知的三酰甘油合成通路,保障三酰甘油的合成。部分二:TAG合成新通路的探索——CDS1回补TAG的机制研究。在细胞中三酰甘油TAG的合成主要受PAH1(人类中为LPIN1)所编码的磷脂磷酸酶调控,由磷脂磷酸酶(PAP)催化磷脂酸(PA)去磷酸化产生二酰甘油是酵母和哺乳动物中三酰甘油合成的关键步骤。当磷脂磷酸酶介导的三酰甘油合成受阻时,如PAH1的缺陷,将直接导致脂滴数量减少95%,三酰甘油含量下降63%。酵母细胞中除了PAH1编码的磷脂磷酸酶,还有APP1,DPP1和LPP1编码的其他磷脂磷酸酶。然而最新的研究显示磷脂的PAP介导的TAG合成并非的唯一途径,在现有磷脂磷酸酶编码基因缺陷的情况下(pah1Δapp1Δdpp1Δlpp1Δ)细胞内仍然能够检测到二酰甘油和三酰甘油合成,这表明存在一条未知的DAG合成旁路能够在细胞磷脂磷酸酶缺失情况下,继续维持三酰甘油低水平的动态平衡。为了找出三酰甘油合成新通路,我们利用三酰甘油合成缺陷后会表现出对黄连素敏感这一表型,筛选了PAH1功能互补基因,在筛选中我们找到了21个黄连素耐受菌株,共13个耐受基因CDS1,NSA2,LSM3,DED8,CNS1和SFH1等,其中的CDS1被发现能够显著回补PAH1缺陷后导致的三酰甘油减少(恢复至正常水平的73.95%)。CDS1所编码的磷脂酸胞苷酰转移酶是催化磷脂酸PA转变CDP-DAG的关键酶,在维持磷脂平衡中起重要作用。过表达CDS1能够显著增加pah1?缺陷菌株磷脂酸肌醇(PI)水平,并通过磷脂酸肌醇重合通路,合成二酰甘油及三酰甘油。更重要的是细胞内存在一种回馈调控机制,在PAH1缺陷情况下,细胞会显著提高CDS1的表达水平来维持三酰甘油内稳态。而其机制是:三酰甘油合成出现障碍时,磷脂酸会急剧积累,并与CDS1上游的抑制子Opi1p在细胞核膜中结合,从而丧失对CDS1的抑制活性。而CDS1在无Opi1p抑制的情况下,表达水平会大幅度上升,从而弥补PAH1缺陷所导致的三酰甘油合成减少。这一发现将进一步揭示三酰甘油合成调控及补救机制,为肥胖及肥胖相关疾病研究提供基础数据。部分三:黄连素降三酰甘油机制的研究。通过药物抑制三酰甘油合成来是目前治疗肥胖最重要手段之一,常见的降脂药物如,普洛萘尔、克伦特罗均能显著降低细胞内三酰甘油水平,抑制脂肪沉积,缓解肥胖及肥胖相关疾病。黄连素作为中国传统的抗菌药物显示出了强降脂活性,能够显著改善脂质代谢紊乱和糖尿病,作为降脂药物和糖尿病治疗药物使用。最新的研究显示黄连素的降脂活性,特别是降三酰甘油活性可能与其磷脂磷酸酶抑制活性密切相关。在该部分的研究中,我们利用酵母模型来研究黄连素的降脂机制,发现0.5g/L黄连素能够使酵母脂滴减少47.12%,并使三酰甘油含量减少47.34%。黄连素的降脂活性与磷脂磷酸酶的编码基因PAH1密切相关,黄连素对PAH1的表达有显著的抑制作用。而PAH1启动子上存在Fkh1p,Rfx1p,Tfc7p,Yap1p,Yap6p和Zap1p多个转录调控因子,而在这些转录调控因子中,YAP1的缺陷会导致黄连素对PAH1的抑制作用消失。在进一步的研究中,我们发现在PAH1启动子区(-960~-728bp)存在一个疑似的Yap1p(YAP1编码)识别位点(ARE:5’-TTA[AG]TAA-3’)。作为氧化应激转录调控因子的Yap1p能够在氧化反应发生时,通过该位点诱导细胞PAH1的表达,而黄连素能够清除细胞代谢过程中产生的氧自由基,抑制Yap1p对PAH1的诱导作用,降低PAH1表达水平,降低细胞内的三酰甘油水平。这些发现将使我们对肥胖与氧化胁迫之间的关系有更深入的认识,更为黄连素在肥胖及肥胖相关疾病研究及治疗领域的应用奠定基础。部分四:黄连素降脂活性在抗菌增效方面的重要作用。真菌感染问题日趋普遍,特别是导管、插管和器官移植的患者,真菌感染发生率和病死率均有明显的增加,真菌感染已成为重症患者治疗时的头号杀手。抗真菌药物是目前应对真菌感染最有效的手段。目前深部、全身性真菌感染的单一药物疗法普遍采用氟康唑为代表的三唑类抗真菌药物,但随着氟康唑大量长期滥用,导致了真菌氟康唑耐药性问题的日趋严重,氟康唑耐药已成为抗真菌治疗失败的最主要原因。氟康唑耐药性问题已成为人们竞相研究的热点问题。黄连素除具有降脂活性外,还具有抗菌作用,我们发现黄连素抗菌增效作用与其降脂活性密切相关,黄连素能够显著提高氟康唑等唑类抗真菌药物、两性霉素B及制霉菌素的抗菌活性,而黄连素增效抗菌效果会受到油酸、三酰甘油、磷脂酰胆碱及麦角固醇等脂肪酸的影响。我们对三酰甘油、磷脂酰胆碱和麦角固醇合成相关缺陷菌株进行氟康唑敏感性筛选,发现三酰甘油合成相关缺陷菌株pah1?及磷脂酰胆碱合成相关缺陷菌株psd1?表现出对氟康唑轻微的敏感性,而磷脂酰乙醇胺转变磷脂酰胆碱中起关键作用的CHO2的缺陷会使酵母表现出对氟康唑极强的耐受性。磷脂酰乙醇胺直接影响细胞药物外排泵活性,影响细胞对氟康唑的敏感性。黄连素抑制了磷脂酰乙醇胺合成相关基因PSD1的表达,减少了磷脂酰乙醇胺合成,降低酵母药物外排泵活性,提高氟康唑敏感性,从而增强氟康唑抗菌效果。这些发现将使我们对黄连素降脂及抗菌增效机制有更深入的认识,同时也为黄连素在抗真菌治疗领域中的应用奠定基础。本文通过系统性的研究TAG调控及相关化合物黄连素作用机制,一方面,阐明了细胞三酰甘油合成通路缓解油酸脂毒胁迫机制,并在现有的磷脂磷酸酶介导的三酰甘油合成通路之外,新发现一条CDS1介导的三酰甘油合成通路,为相关降脂药物的研发提供了新的靶点。另一方面,揭示了黄连素是通过自身抗氧化活性来抑制磷脂磷酸酶表达的降脂机制,发现了黄连素是通过抑制磷脂酰乙醇胺合成来降低酵母药物外排泵活性提高氟康唑敏感性的抗菌增效机制。这些发现将会促进肥胖及肥胖相关疾病的防治及研究工作的发展,同时提升我国传统中医黄连素的应用价值。