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胃癌(Gastric cancer, GC)是全球性高发的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织报道，2018年全球新增胃癌1033701例，死亡782685例，发病率和病死率均高居不下。在中国，由于饮食习惯的特殊性(喜食腌制食物、熏制食物、共用餐具等)，导致亚硝酸盐摄入过多，人群中感染幽门螺旋杆菌患者占比大，造成了我国胃癌的发病率和病死率比世界平均水平高。在已确诊胃癌患者中，中、晚期占绝大多数，对胃癌的防治工作带来了巨大的挑战。对于中、晚期胃癌，目前最主要的治疗方法是以手术切除和放化疗为主，免疫治疗、分子靶向治疗等为辅。对于晚期胃癌不能切除伴或不伴有腹腔种植、肝、肺等远处转移的患者，尽管免疫治疗和分子靶向等治疗能在一定程度上能缓解疾病的进展，但仍然不能改变疾病的最终进程。因此，如何早期发现及预测胃癌的进展以及局部或远处复发、转移是进展期胃癌防治的关键。所以，寻找胃癌发生早期转移的标志物及有效的分子治疗靶点对中、晚期胃癌的治疗具有重大的临床指导意义。
CircRNAs(环状RNA)是一类特殊的非编码RNA分子，通过反向互补配对剪切机制成环。从20世纪90年代发现至今已经40多年。从一开始被认为是转录过程中的“副产品”到逐渐被人们认识到具有许许多多重要的生理、病理功能：1.通过海绵样作用miRNA(microRNA，微小RNA)调节下游基因表达；2.通过吸附RNA结合蛋白从而调节下游基因表达；3.可与功能蛋白结合，从而影响其表达或功能；4.部分外显子环状RNA具有翻译成蛋白的功能等等。通过circRNA表达谱芯片分析我们发现了一个在胃癌中表达下调的circRNA:has_circ_0004873(亲本基因为OXCT1，故命名为circ-OXCT1)。结合患者的临床数据分析及生存分析我们发现，circ-OXCT1的表达水平不但与胃癌的肿瘤T分期、TNM分期以及N分期显著相关：各分期越晚的胃癌患者circ-OXCT1表达水平就越低；还与患者的5年生存率显著相关：circ-OXCT1表达水平越低，患者的5年总生存率就越低。Circ-OXCT1是通过什么机制影响胃癌的分期、淋巴结转移以及预后的呢？考虑到上皮-间质转化(EMT)在恶性肿瘤中导致肿瘤细胞异型性及增强细胞侵袭、转移中发挥的重要作用，我们推测circ-OXCT1能够通过影响胃癌细胞EMT功能从而调控胃癌细胞的侵袭以及转移功能。希望借此找到一个新的胃癌细胞发生侵袭、转移的标志物，从而为预防和治疗胃癌发生局部浸润以及侵袭、转移提供新的治疗靶点。
本研究旨在探讨circ-OXCT1与胃癌细胞EMT的关系，从而为胃癌发生局部浸润以及侵袭、转移的患者提供新的治疗靶点。本研究主要由如下三个方面组成：
第一部分circ-OXCT1在胃癌中的表达及临床意义
目的：
探讨circ-OXCT1在胃癌临床标本中的表达情况以及circ-OXCT1的表达水平与胃癌患者在临床病理特征、预后之间的关系。
方法：
(1)收集74对我院胃癌术后癌和癌旁的组织标本，提取总RNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测癌和癌旁组织中circ-OXCT1的表达水平；
(2)分析circ-OXCT1表达水平与患者临床病理特征之间的关系；
(3)同时通过生存分析(Overall Survival, OS)探讨circ-OXCT1与患者预后的相关性。
结果：
(1 )Circ-OXCT1在胃癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.00)，癌旁组织中的表达水平约是癌组织中的3.9倍；
(2 )临床病理分析表明circ-OXCT1表达水平与胃癌的T分期(p=0.021)、TNM分期(p=0.017)以N分期(及淋巴结转移)(p=0.024)显著相关:circ-OXCT1表达水平越低，则T分期及TNM分期就越高，且区域淋巴结转移就越多，但其与患者年龄、性别、细胞分化程度、Borrmann分型等均无显著相关性；
(3)生存分析表明circ-OXCT1低表达患者具有更短的5年总生存率。
结论：
(1)Circ-OXCT1在胃癌组织中低表达；
(2)低表达的circ-OXCT1预示着患者更容易进展成中、晚期胃癌以及更容易发生淋巴结转移；
(3)且低表达的circ-OXCT1预示着患者更短的生存时间，更差的预后，因此可以作为胃癌复发、淋巴结转移以及远处转移的的判断指标。
第二部分Circ-OXCT1通过海绵样作用miR-136调控胃癌细胞SMAD4的表达
目的：
探讨circ-OXCT1对胃癌细胞增值、侵袭，以及对裸鼠成瘤和肺转移的影响并探讨其可能的机制。
方法：
(1)利用qRT-PCR检测胃癌细胞株(AGS、MKN28、MKN45、MGC803、BGC823)中circ-OXCT1的表达情况，筛选出表达最低的和最高的各2株细胞；
(2)慢病毒质粒构建，转染低表达胃癌细胞株用以过表达circ-OXCT1以及利用si-RNAs处理高表达细胞株用以敲低circ-OXCT1；
(3)细胞功能实验(平板克隆、CCK-8、划痕、Transwell)验证过表达或敲低circ-OXCT1后对胃癌细胞增值、侵袭等相关恶性生物学行为的影响；
(4)裸鼠实验验证过表达circ-OXCT1后对裸鼠皮下成瘤以及肺转移的影响；
(5)通过CircInteractome和StarBasev3.0网络预测工具预测能与circ-OXCT1结合且结合效能较高的miRNAs并取交集，用双荧光素酶实验和FISH实验验证并筛选预测的miRNAs；
(6)通过miRanda和StarBasev3.0预测筛选后的miRNAs的下游结合基因并找到可能与上皮-间质转化关联的基因；
结果：
(1)通过qRT-PCR实验得出circ-OXCT1在胃癌细胞株AGS和MGC803中表达最低，在MKN28和MKN45中表达最高；
(2)病毒转染AGS和MGC803这两株胃癌细胞后，circ-OXCT1在AGS中升高到原来的8倍左右，在MGC803中升高到原来的4倍左右；筛选出si-circ-OXCT1-1敲低MKN28和MKN45中的circ-OXCT1，发现circ-OXCT1在MKN28中的表达约是敲低前的1/30，在MKN45中的表达约敲低前的1/20；
(3)平板克隆实验、CCK-8以及裸鼠成瘤实验证实circ-OXCT1过表达或敲低均对胃癌细胞的增值无显著影响，差异无统计学意义，但划痕实验、Transwell以及裸鼠肺转移等相关实验证实circ-OXCT1过表达后可以显著抑制胃癌细胞的迁移、侵袭功能以及裸鼠肺转移，circ-OXCT1敲低后可以显著促进胃癌细胞的迁移、侵袭功能；
(4 )通过CircInteractome和StarBasev3.0预测到可能与circ-OXCT1结合且结合效能较高的miRNAs有：miR-136、miR-145和miR-665，双荧光素酶实验以及FISH实验证实其中只有miR-136能较好地与circ-OXCT1结合，且结合部位主要在胞质区；
(5)通过miRanda和StarBasev3.0预测到miR-136能与EMT相关的下游基因SMAD4的编码区相结合，敲低或过表达miR-136可以下调或上调SMAD4的蛋白表达水平。
结论：
(1)Circ-OXCT1在胃癌细胞株AGS和MGC803中表达最低，在MKN28和MKN45中表达最高；
(2)过表达或敲低circ-OXCT1对胃癌细胞的增值能力均无显著影响，但过表达circ-OXCT1显著抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭能力以及裸鼠的肺转移能力，敲低circ-OXCT1显著促进了胃癌细胞的迁移和侵袭能力；
(3)Circ-OXCT1能与miR-136结合，而miR-136能结合SMAD4的编码区从而调控SMAD4的蛋白表达水平，预示胃癌中存在着circ-OXCT1/miR-136/SMAD4调控轴。
第三部分Circ-OXCT1通过miR-136/SMAD4轴阻断TGF-β通路从而抑制胃癌细胞的EMT功能
目的：
探讨circ-OXCT1通过什么途径作用于胃癌细胞上皮-间质转化以及如何影响胃癌细胞的迁移、侵袭功能。
方法：
(1)回复实验1：用miR-136mimics处理circ-OXCT1过表达胃癌细胞系，观察EMT相关蛋白表达水平的变化；
(2)回复实验2：用miR-136inhibitor处理circ-OXCT1敲低胃癌细胞系，观察EMT相关蛋白表达水平的变化；
(3)用TGF-β受体抑制剂LY2109761处理胃癌细胞系，随后用circ-OXCT1过表达质粒处理细胞，观察circ-OXCT1过表达后能否逆转LY2109761对EMT相关蛋白表达水平的的影响；
(4)建立circ-OXCT1-miRNAs-EMT联系，运用AI图示呈现。
结果：
(1)慢病毒处理胃癌细胞系AGS过表达circ-OXCT1后，E-钙粘蛋白表达水平显著降低，SMAD4、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平均显著升高，用miR-136mimics处理该细胞后，发现可以逆转circ-OXCT1过表达所引起的SMAD4以及EMT相关蛋白表达水平的变化；
(2)Si-circ-OXCT1-1处理胃癌细胞系KMN28后E-钙粘蛋白表达水平显著升高；N-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平均显著降低，用miR-136inhibitor处理该细胞后，发现可以逆转circ-OXCT1敲低所引起的SMAD4以及EMT相关蛋白表达水平的变化；
(3)Circ-OXCT1可以回复TGF-β受体抑制剂LY2109761所引起的E-钙粘蛋白上调，N钙粘蛋白和波形蛋白下调等胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响。
结论：
(1 )MiR-136mimics可以回复circ-OXCT1过表达对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响；
(1)MiR-136inhibitor可以回复circ-OXCT1敲低对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响；
(3)TGF-β受体抑制剂LY2109761可显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭功能；
(4)Circ-OXCT1可以逆转TGF-β受体抑制剂LY2109761对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响。通过以上实验，我们证实了circ-OXCT1/miR-136/SMAD4调控轴通过TGF-β信号通路调控胃癌细胞的EMT功能，为中、晚期胃癌特别是伴有淋巴结或远处转移的胃癌患者提供新的治疗靶点和思路。
CircRNAs(环状RNA)是一类特殊的非编码RNA分子，通过反向互补配对剪切机制成环。从20世纪90年代发现至今已经40多年。从一开始被认为是转录过程中的“副产品”到逐渐被人们认识到具有许许多多重要的生理、病理功能：1.通过海绵样作用miRNA(microRNA，微小RNA)调节下游基因表达；2.通过吸附RNA结合蛋白从而调节下游基因表达；3.可与功能蛋白结合，从而影响其表达或功能；4.部分外显子环状RNA具有翻译成蛋白的功能等等。通过circRNA表达谱芯片分析我们发现了一个在胃癌中表达下调的circRNA:has_circ_0004873(亲本基因为OXCT1，故命名为circ-OXCT1)。结合患者的临床数据分析及生存分析我们发现，circ-OXCT1的表达水平不但与胃癌的肿瘤T分期、TNM分期以及N分期显著相关：各分期越晚的胃癌患者circ-OXCT1表达水平就越低；还与患者的5年生存率显著相关：circ-OXCT1表达水平越低，患者的5年总生存率就越低。Circ-OXCT1是通过什么机制影响胃癌的分期、淋巴结转移以及预后的呢？考虑到上皮-间质转化(EMT)在恶性肿瘤中导致肿瘤细胞异型性及增强细胞侵袭、转移中发挥的重要作用，我们推测circ-OXCT1能够通过影响胃癌细胞EMT功能从而调控胃癌细胞的侵袭以及转移功能。希望借此找到一个新的胃癌细胞发生侵袭、转移的标志物，从而为预防和治疗胃癌发生局部浸润以及侵袭、转移提供新的治疗靶点。
本研究旨在探讨circ-OXCT1与胃癌细胞EMT的关系，从而为胃癌发生局部浸润以及侵袭、转移的患者提供新的治疗靶点。本研究主要由如下三个方面组成：
第一部分circ-OXCT1在胃癌中的表达及临床意义
目的：
探讨circ-OXCT1在胃癌临床标本中的表达情况以及circ-OXCT1的表达水平与胃癌患者在临床病理特征、预后之间的关系。
方法：
(1)收集74对我院胃癌术后癌和癌旁的组织标本，提取总RNA，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测癌和癌旁组织中circ-OXCT1的表达水平；
(2)分析circ-OXCT1表达水平与患者临床病理特征之间的关系；
(3)同时通过生存分析(Overall Survival, OS)探讨circ-OXCT1与患者预后的相关性。
结果：
(1 )Circ-OXCT1在胃癌组织中的表达显著低于癌旁组织(p<0.00)，癌旁组织中的表达水平约是癌组织中的3.9倍；
(2 )临床病理分析表明circ-OXCT1表达水平与胃癌的T分期(p=0.021)、TNM分期(p=0.017)以N分期(及淋巴结转移)(p=0.024)显著相关:circ-OXCT1表达水平越低，则T分期及TNM分期就越高，且区域淋巴结转移就越多，但其与患者年龄、性别、细胞分化程度、Borrmann分型等均无显著相关性；
(3)生存分析表明circ-OXCT1低表达患者具有更短的5年总生存率。
结论：
(1)Circ-OXCT1在胃癌组织中低表达；
(2)低表达的circ-OXCT1预示着患者更容易进展成中、晚期胃癌以及更容易发生淋巴结转移；
(3)且低表达的circ-OXCT1预示着患者更短的生存时间，更差的预后，因此可以作为胃癌复发、淋巴结转移以及远处转移的的判断指标。
第二部分Circ-OXCT1通过海绵样作用miR-136调控胃癌细胞SMAD4的表达
目的：
探讨circ-OXCT1对胃癌细胞增值、侵袭，以及对裸鼠成瘤和肺转移的影响并探讨其可能的机制。
方法：
(1)利用qRT-PCR检测胃癌细胞株(AGS、MKN28、MKN45、MGC803、BGC823)中circ-OXCT1的表达情况，筛选出表达最低的和最高的各2株细胞；
(2)慢病毒质粒构建，转染低表达胃癌细胞株用以过表达circ-OXCT1以及利用si-RNAs处理高表达细胞株用以敲低circ-OXCT1；
(3)细胞功能实验(平板克隆、CCK-8、划痕、Transwell)验证过表达或敲低circ-OXCT1后对胃癌细胞增值、侵袭等相关恶性生物学行为的影响；
(4)裸鼠实验验证过表达circ-OXCT1后对裸鼠皮下成瘤以及肺转移的影响；
(5)通过CircInteractome和StarBasev3.0网络预测工具预测能与circ-OXCT1结合且结合效能较高的miRNAs并取交集，用双荧光素酶实验和FISH实验验证并筛选预测的miRNAs；
(6)通过miRanda和StarBasev3.0预测筛选后的miRNAs的下游结合基因并找到可能与上皮-间质转化关联的基因；
结果：
(1)通过qRT-PCR实验得出circ-OXCT1在胃癌细胞株AGS和MGC803中表达最低，在MKN28和MKN45中表达最高；
(2)病毒转染AGS和MGC803这两株胃癌细胞后，circ-OXCT1在AGS中升高到原来的8倍左右，在MGC803中升高到原来的4倍左右；筛选出si-circ-OXCT1-1敲低MKN28和MKN45中的circ-OXCT1，发现circ-OXCT1在MKN28中的表达约是敲低前的1/30，在MKN45中的表达约敲低前的1/20；
(3)平板克隆实验、CCK-8以及裸鼠成瘤实验证实circ-OXCT1过表达或敲低均对胃癌细胞的增值无显著影响，差异无统计学意义，但划痕实验、Transwell以及裸鼠肺转移等相关实验证实circ-OXCT1过表达后可以显著抑制胃癌细胞的迁移、侵袭功能以及裸鼠肺转移，circ-OXCT1敲低后可以显著促进胃癌细胞的迁移、侵袭功能；
(4 )通过CircInteractome和StarBasev3.0预测到可能与circ-OXCT1结合且结合效能较高的miRNAs有：miR-136、miR-145和miR-665，双荧光素酶实验以及FISH实验证实其中只有miR-136能较好地与circ-OXCT1结合，且结合部位主要在胞质区；
(5)通过miRanda和StarBasev3.0预测到miR-136能与EMT相关的下游基因SMAD4的编码区相结合，敲低或过表达miR-136可以下调或上调SMAD4的蛋白表达水平。
结论：
(1)Circ-OXCT1在胃癌细胞株AGS和MGC803中表达最低，在MKN28和MKN45中表达最高；
(2)过表达或敲低circ-OXCT1对胃癌细胞的增值能力均无显著影响，但过表达circ-OXCT1显著抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭能力以及裸鼠的肺转移能力，敲低circ-OXCT1显著促进了胃癌细胞的迁移和侵袭能力；
(3)Circ-OXCT1能与miR-136结合，而miR-136能结合SMAD4的编码区从而调控SMAD4的蛋白表达水平，预示胃癌中存在着circ-OXCT1/miR-136/SMAD4调控轴。
第三部分Circ-OXCT1通过miR-136/SMAD4轴阻断TGF-β通路从而抑制胃癌细胞的EMT功能
目的：
探讨circ-OXCT1通过什么途径作用于胃癌细胞上皮-间质转化以及如何影响胃癌细胞的迁移、侵袭功能。
方法：
(1)回复实验1：用miR-136mimics处理circ-OXCT1过表达胃癌细胞系，观察EMT相关蛋白表达水平的变化；
(2)回复实验2：用miR-136inhibitor处理circ-OXCT1敲低胃癌细胞系，观察EMT相关蛋白表达水平的变化；
(3)用TGF-β受体抑制剂LY2109761处理胃癌细胞系，随后用circ-OXCT1过表达质粒处理细胞，观察circ-OXCT1过表达后能否逆转LY2109761对EMT相关蛋白表达水平的的影响；
(4)建立circ-OXCT1-miRNAs-EMT联系，运用AI图示呈现。
结果：
(1)慢病毒处理胃癌细胞系AGS过表达circ-OXCT1后，E-钙粘蛋白表达水平显著降低，SMAD4、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平均显著升高，用miR-136mimics处理该细胞后，发现可以逆转circ-OXCT1过表达所引起的SMAD4以及EMT相关蛋白表达水平的变化；
(2)Si-circ-OXCT1-1处理胃癌细胞系KMN28后E-钙粘蛋白表达水平显著升高；N-钙粘蛋白和波形蛋白表达水平均显著降低，用miR-136inhibitor处理该细胞后，发现可以逆转circ-OXCT1敲低所引起的SMAD4以及EMT相关蛋白表达水平的变化；
(3)Circ-OXCT1可以回复TGF-β受体抑制剂LY2109761所引起的E-钙粘蛋白上调，N钙粘蛋白和波形蛋白下调等胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响。
结论：
(1 )MiR-136mimics可以回复circ-OXCT1过表达对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响；
(1)MiR-136inhibitor可以回复circ-OXCT1敲低对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响；
(3)TGF-β受体抑制剂LY2109761可显著抑制胃癌细胞的迁移和侵袭功能；
(4)Circ-OXCT1可以逆转TGF-β受体抑制剂LY2109761对胃癌细胞EMT相关蛋白表达水平的影响。通过以上实验，我们证实了circ-OXCT1/miR-136/SMAD4调控轴通过TGF-β信号通路调控胃癌细胞的EMT功能，为中、晚期胃癌特别是伴有淋巴结或远处转移的胃癌患者提供新的治疗靶点和思路。