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大约95％以上病原微生物都是通过黏膜途径入侵机体的，因此黏膜免疫日益受到人们的重视。一般认为黏膜免疫主要是通过多聚免疫球蛋白受体(pIgR)介导IgA转运到黏膜表面发挥作用。研究发现，在黏膜分泌物中也存在一定量的IgG，并在黏膜表面保护机体防止病原入侵的过程中起到重要作用。而IgG转运到黏膜表面主要是通过新生儿Fc受体(FcRn)介导的。目前大量的研究主要集中在对人和小鼠的FcRn功能及表达调控方面的研究，但是对于猪源的FcRn功能的研究比较少，同时国内外尚未见到有关病原感染对FcRn表达调控方面的研究。因此，本研究拟应用猪小肠上皮细胞系（IPEC-J2）构建体外胞转模型，研究猪FcRn介导IgG的转运功能;同时研究猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn的表达调控。取得的主要研究结果如下: 1.猪小肠上皮细胞FcRn的表达及分布 根据已经报道的猪FcRnα链基因序列设计特异性引物，以IPEC-J2细胞的总RNA为模板，利用RT-PCR方法扩增获得了FcRnα链基因片段。经Westernblot检测发现FcRn蛋白在IPEC-J2细胞系上的表达。进一步通过间接免疫荧光检测发现FcRn主要分布在极化的IPEC-J2细胞的顶膜侧;仔猪空肠组织切片检测结果也显示FcRn主要分布在小肠绒毛上皮细胞的顶膜侧。 2.猪FcRn介导IgG双向胞转作用的研究 以IPEC-J2细胞构建体外胞转模型，将生物素标记的猪IgG(biotin-IgG)加入到胞转模型，进行Western blot检测。结果发现极化的IPEC-J2细胞在37℃可以双向转运IgG，在4℃不能转运IgG。以上结果证明IgG是跨细胞途径转运穿过上皮细胞屏障。为了进一步研究IgG跨极化上皮细胞双向转运是由FcRn特异性介导的，在biotin-IgG胞转过程中加入protein A或未标记的IgG作为抑制剂。结果显示在加入protein A或未标记的IgG后，明显抑制了IgG双向转运。激光共聚焦显微镜结果也证明了FcRn可以与IgG在细胞内结合并介导IgG跨上皮细胞转运。运用免疫共沉淀的方法证明了FcRn与IgG结合是pH依赖的，即在酸性条件下pH＜6.5，FcRn与IgG结合，在中性偏碱性条件下pH＞7.0，FcRn与IgG不结合。由于FcRn可以介导IgG的转运，因此，在胞转模型中，以TGEV为模式病原，将抗TGEV特异性IgG加入到细胞底侧小室，在极化的IPEC-J2细胞顶侧小室加入0.1 MOI TGEV病毒液。结果发现FcRn转运特异性IgG能够中和病毒。以上结果说明FcRn介导IgG转运穿过黏膜屏障，在保护机体防止病原通过黏膜表面入侵的过程中起到重要作用。 3.TGEV感染IPEC-J2细胞激活NF-κB信号通路对FcRn表达调控的研究 NF-κB是一个广泛表达的转录因子，主要涉及与免疫应答、炎症反应、细胞分化相关的基因转录。本研究发现TGEV感染IPEC-J2细胞能够激活NF-κB信号通路。首先，运用NF-κB荧光素酶报告系统检测TGEV感染IPEC-J2细胞对NF-κB的激活情况，结果发现能显著增强NF-κB荧光素酶活性。进一步通过pEGFP-p65质粒转染IPEC-J2细胞，在TGEV感染后，激光共聚焦显微镜结果显示p65转位入核。TGEV感染IPEC-J2细胞，通过荧光定量PCR和Western blot方法检测发现能显著上调FcRn的表达。经在线软件分析FcRn启动子转录因子结合位点，发现除了具有NF-κB转录因子结合位点还有MAPK下游的转录因子结合位点，因此为了确定NF-κB和MAPK在FcRn上调表达中的作用，应用NF-κB抑制剂和MAPK相关抑制剂处理细胞，结果发现NF-κB抑制剂处理的细胞能显著抑制TGEV诱导的FcRn表达，而MAPK抑制剂处理的细胞不影响TGEV诱导的FcRn表达。说明FcRn的上调表达与NF-κB信号通路密切相关。进一步根据在线软件预测转录因子结合位点将FcRn启动子区域不断截短，最终构建了9个不同长度的FcRn启动子荧光素酶报告质粒，经荧光素酶活性检测发现FcRn启动子区NF-κB主要结合位点位于上游的-1381～-208之间。最后应用染色质免疫共沉淀(CHIP)和凝胶迁移实验(EMSA)证明这个区域具有4个p65转录因子结合位点。