参夏合剂和巴西苏木素治疗动脉粥样硬化的免疫机制研究

来源 :山东中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cx8105
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目的:通过临床研究探讨参夏合剂治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)受试者的疗效评价及其对受试者外周血中PD-1表达的影响;体外培养THP-1细胞系探究参夏合剂和巴西苏木素抗AS的炎症免疫指标如PD-1、TLR-4、NF-κB及MMP-9的m RNA水平和蛋白表达情况;基于细胞实验的结果,进一步在Apo E小鼠体内探讨参夏合剂和巴西苏木素对小鼠主动脉斑块形成的作用及对CD4+T、CD8+T、巨噬细胞和PD-1表达的影响。方法:1.根据纳入、排除标准,选择符合要求的40例AS患者,随机分为对照组和试验组,分别给予辛伐他汀和参夏合剂治疗4周,观察两组受试者治疗前后的外周血中PD-1表达情况、血脂、超敏C反应蛋白、颈动脉内中膜厚度、斑块面积以及中医证候积分与临床疗效等。2.细胞实验:选择人单核细胞系THP-1,PMA和LPS联合诱导为AS细胞炎症模型,通过CCK-8法测定辛伐他汀、巴西苏木素和参夏合剂最佳干预浓度,将实验分为5组,分别为对照组(Control)、模型组(Model)、辛伐他汀组(Simvastatin)、巴西苏木素组(Brazilin)和参夏合剂组(SXHJ),通过流式细胞术检测PD-1、TLR-4、NF-κB、MMP-9的表达,q RT-PCR检测不同实验组中PD-1、TLR-4、NF-κB、MMP-9m RNA的表达情况,Elisa检测TNF-α、IL-10细胞因子的浓度,Westernblot检测PD-1、TLR-4、NF-κB、MMP-9的表达,揭示参夏合剂和巴西苏木素对THP-1细胞炎症的效应机制。3.动物实验:10只雄性健康C57BL/6小鼠作为对照组(Control),50只同背景Apo E基因敲除的雄性健康C57BL/6小鼠,按随机数字分组,分为模型组(Model)、辛伐他汀组(Simvastatin)、巴西苏木素组(Brazilin)、参夏合剂组(SXHJ)和抗PD-1抗体组(anti-PD-1),对照组和另外5组分别给予正常普通饲料和高脂饲料喂养,后者用于复制AS模型。分别采用灌胃和腹腔注射方式,分别给予辛伐他汀组(10mg/kg/d)、巴西苏木素组(30mg/kg/d)和参夏合剂组(13g/kg/d)、抗PD-1抗体组(5mg/kg/d)的剂量给药,对照组、模型组小鼠分别用同体积的生理盐水来灌胃。治疗8周以后,检测不同实验组小鼠体重变化、血脂水平、PD-1表达以及通过HE染色、大体油红O染色等组织形态学检测不同实验组小鼠AS病变程度,并通过免疫组化检测表达强度。结果:1.临床研究结果:两组受试者年龄、性别差异均无统计学意义;组内治疗后较治疗前的血脂水平、超敏C反应蛋白差异均有显著性(P<0.05),组间治疗前差异无统计学意义;参夏合剂和辛伐他汀治疗均降低了细胞表面PD-1表达水平,差异有显著性(P<0.05),组间治疗前差异无显著性,治疗后差异有显著性(P<0.05)。治疗前后,组内治疗后较治疗前的颈动脉内中膜厚度变化、斑块面积变化、中医证候积分以及临床疗效差异均有统计学意义(P<0.05);试验组较对照组治疗前差异无显著性,治疗后差异有显著性(P<0.05)。2.细胞实验结果:细胞培养至对数生长期,通过CCK-8法测定药物对THP-1细胞生存率的影响。以IC50的试剂浓度作为最佳药物干预浓度,结果显示,参夏合剂最佳浓度为38.8mg/m L,巴西苏木素最佳浓度为12μg/m L,浓度大于18μg/m L时,细胞存活率变化不大,辛伐他汀的最佳浓度为15μg/m L,并呈浓度依赖性生长。流式细胞术检测PD-1表达,与模型组对比,三组药物均降低了细胞表面PD-1的表达,与对照组相比,参夏合剂组、巴西苏木素组、辛伐他汀组差异均具有显著性(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。Elisa检测TNF-α、IL-10的浓度,结果显示TNF-α在药物组中的浓度有明显降低,与模型组对比,三组药物均具有差异极显著性(P<0.001),辛伐他汀组与参夏合剂组、巴西苏木素组对比,差异均有高度统计学意义(P<0.001),巴西苏木素组与参夏合剂组无统计学差异;IL-10的浓度在药物组中均升高,与模型组对比,辛伐他汀组差异有统计学意义,参夏合剂组和巴西苏木素组差异有极显著性(P<0.001),辛伐他汀组与参夏合剂组对比具有差异有高度统计学意义(P<0.001),与巴西木素组对比无统计学意义。q RT-PCR检测PD-1、NF-κB、TLR-4及MMP-9m RNA表达,结果显示,与模型组对比,除参夏合剂对PD-1m RNA的影响具有统计学意义外,其他试验组的差异均有极显著性;PD-1m RNA的试验组间无统计学差异,MMP-9m RNA的参夏合剂与辛伐他汀组对比差异有极显著性(P<0.001),参夏合剂组与巴西苏木素组对比差异有十分显著性(P<0.01),辛伐他汀组与巴西苏木素组对比差异有统计学意义(P<0.05),TLR-4m RNA的参夏合剂组与辛伐他汀、巴西苏木素组对比均具有差异有极显著性(P<0.001),辛伐他汀组与巴西苏木素组对比差异无统计学意义。Westernblot检测PD-1、NF-κB、TLR-4及MMP-9蛋白表达,与模型组对比,除参夏合剂对MMP-9的表达差异具有十分显著性(P<0.01)外,其他药物组对蛋白表达差异均具有极显著性(P<0.001)。PD-1、MMP-9的不同实验组间比较,差异均有高度统计学意义(P<0.001)。在对NF-κB的表达影响方面,辛伐他汀组与参夏合剂组、巴西苏木素组对比差异有十分显著性(P<0.01),在对TLR-4表达的影响,辛伐他汀组与参夏合剂组、巴西苏木素组对比具有差异有高度统计学意义(P<0.001),参夏合剂组与巴西苏木素组之间无明显统计学差异(P>0.05)。3.动物实验:与对照组对比,模型组小鼠的血清LDL-C、TG和TC均有明显升高,HDL-C具有明显降低,模型组小鼠的动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaque,AP)明显,动脉管腔中出现了不同程度狭窄,动脉内中膜弹力板断裂。与模型组对比,参夏合剂组、巴西苏木素组和辛伐他汀组的血脂水平明显降低,且三组的AS程度轻,但是,抗PD-1抗体组的血脂水平和AS程度均加重。免疫组化显示,与模型组对比,参夏合剂组、巴西苏木素组和辛伐他汀组中PD-1的点状聚集表达明显增强,抗PD-1抗体组中的PD-1点状聚集表达明显减弱,提示参夏合剂和巴西苏木素抗AS与负性免疫具有显著性关联。流式结果显示,模型组与对照组对比差异有统计学意义,说明Apo E小鼠AS模型复制成功。与模型组对比,参夏合剂组、巴西苏木素组和辛伐他汀组中CD4+TCD8+T巨噬细胞和PD-1的表达均降低,且差异有显著性,抗PD-1抗体组中CD4+TCD8+T巨噬细胞和PD-1的表达均升高,且差异有显著性。结论:1.参夏合剂可有效调节AS患者的免疫反应,改善临床证候和预后,而且临床安全性高。2.参夏合剂和巴西苏木素对PD-1、TLR-4、NF-κB及MMP-9异常激活具有抑制作用,是既可以降血脂又具有免疫调节和抗炎活性的抗AS的良好药物,为未来筛选、创新抗AS药物奠定了坚实的理论基础。3.“微观癥积”的理论提出对于参夏合剂治疗AS具有很好的指导作用,能够更加有效的将肿瘤疾病与AS的治疗紧密结合,为解决当前世界两大疾病群提供思路和方向。
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