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第一部分影响早期胚胎发育的卵丘细胞中m RNA表达谱的研究【目的】本实验采用Arraystar human m RNA表达谱芯片技术检测人MⅡ卵母细胞周围卵丘细胞中对影响早期胚胎发育的m RNAs表达水平,并对差异表达的m RNAs进行筛选分析和验证。【方法】1.收集在我中心接受IVF-ET治疗的患者的卵丘细胞,按照胚胎质量各自对应分组,发育成优质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为优质胚胎卵丘细胞组（A组）,发育成劣质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为劣质胚胎卵丘细胞组（B组）。检测6个样本的RNA总量以保证符合芯片检测要求。对卵丘细胞样本中RNA通过逆转录获得Cy3荧光染料标记的a RNA,采用Arraystar Human m RNA V2.0表达谱芯片（8x60K,Arraystar）检测卵丘细胞样本中m RNA表达水平,Agilent Feature Extraction（version 11.0.1.1）软件提取获得的微阵列图像原始信号值,Gene Spring GX verision12.1软件包（Agilent Technologies）对获取的m RNA原始信号值进行标准化处理并质量评估。2.采用两分类的差异基因筛选方法对差异mRNAs进行筛选,火山图和聚类分析图显示两组卵丘细胞中差异m RNAs表达情况。应用基因富集分析方法进一步分析差异表达的m RNAs,分别进行GO分析和KEGG pathway分析。3.差异mRNAs的Real-time PCR验证筛选相关的mRNAs,挑选目的基因,采用实时定量PCR验证其表达水平。【结果】1.对接受IVF-ET治疗患者中,选取的3例患者6个样本的卵丘细胞经检测均符合m RNA表达谱芯片检测的要求。其中,A组样本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分别为1.95、1.92、2.04;B组样本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分别为2.05、2.00、1.94。两组样本符合芯片检测实验要求。对卵丘细胞样本中RNA进行反转录并用Cy3荧光染料进行标记,特异性标记活性为（pmol/ml染料）/（mg/ml c RNA）,A组（4A、5A、7A）分别为21.42、21.70、20.64,B组（4B、5B、7B）分别为21.25、21.47、21.00,符合芯片检测实验要求。两组样本中共检测到m RNA靶基因数15797个;过滤后数据质量评估,用箱体图分析显示6个样本m RNAs表达水平接近在一个水平。散点图分析结果显示两组卵丘细胞中存在大量差异表达的m RNAs。2.两样本间差异表达mRNAs的筛选分析,检测到差异表达的mRNAs 810个,其中B组vs A组上调表达的m RNAs是91个,B组vs A组下调表达的m RNAs是719个。对差异表达的m RNAs进行GO分析,结果显示,B组vs A组上调表达的m RNA中,参与生物学过程的基因数是112个,参与细胞组成的基因数是24个,参与分子功能的基因数是22个。在B组vs A组下调表达的m RNA中,参与生物学过程的基因数是389个,参与细胞组成的基因数是94个,参与分子功能的基因数是85个。对差异表达的m RNAs信号通路分析,结果显示,B组vs A组上调表达的m RNA基因参与了5条信号通路,下调表达的m RNA基因参与了12条信号通路。3.挑选差异基因RT-PCR验证结果进行实时荧光定量PCR验证,结果与芯片表达结果一致。【结论】发育成不同质量卵裂期胚胎的人MⅡ期卵母细胞周围的卵丘细胞间存在大量差异表达的m RNAs;GO分析和pathway分析提示卵丘细胞中这些差异表达的m RNAs参与了各种生物学途径和信号通路对早期胚胎发育的调控。这些m RNAs的表达上调或下调,可能进一步导致蛋白质的表达变化,从而影响卵母细胞的发育和早期胚胎的发育。第二部分影响早期胚胎发育的卵丘细胞中lnc RNA表达谱的研究及其与m RNA关联分析【目的】本实验采用Arraystar human lnc RNA表达谱芯片技术检测人MⅡ卵母细胞周围卵丘细胞中对影响早期胚胎发育的lnc RNAs表达水平,对差异表达的lnc RNAs进行筛选分析和验证。并将差异表达的lnc RNAs与m RNAs关联分析。【方法】1.收集在我中心接受IVF-ET治疗的3名患者的卵丘细胞,按照胚胎质量各自对应分组,发育成优质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为优质胚胎卵丘细胞组（A组）,发育成劣质胚胎的卵母细胞周围的卵丘细胞为劣质胚胎卵丘细胞组（B组）。检测6个样本的RNA总量以保证符合芯片检测要求。对卵丘细胞样本中RNA通过逆转录获得Cy3荧光染料标记的a RNA,采用Arraystar Human lnc RNA V2.0表达谱芯片（8x60K,Arraystar）检测卵丘细胞样本中lnc RNA表达水平,Agilent Feature Extraction（version 11.0.1.1）软件对获得的微阵列图像提取原始信号值,Gene Spring GX软件包（Agilent Technologies,verision12.1）对获取的lnc RNA原始信号值进行标准化处理并质量评估。2.采用两分类的差异基因筛选方法对差异lnc RNAs进行筛选,火山图和聚类分析图显示两组卵丘细胞中差异lnc RNAs表达情况。根据lnc RNA在染色体上的位置和已知功能分类对芯片检测出来的差异表达lnc RNA进行分类和亚组分析。3.筛选相关的lncRNAs,挑选目的lncRNAs,采用实时定量PCR验证其表达水平。根据芯片数据比较差异m RNAs和lnc RNAs,试图寻找出共同表达上调或者下调的基因。以与卵丘细胞、早期胚胎发育密切相关为基础,对于PCR结果与芯片结果一致的m RNAs和lnc RNAs,分别采用CNC网络图分析,建立二者之间的联系,并初步构建lnc RNA与m RNA的调控网络。【结果】1.对接受IVF-ET治疗患者中,选取的3例患者6个样本的卵丘细胞经检测均符合lnc RNA表达谱芯片检测的要求。其中,A组样本（4A、5A、7A）中RNA OD260/280比值分别为1.95、1.92、2.04;B组样本（4B、5B、7B）中RNA OD260/280比值分别为2.05、2.00、1.94。两组样本符合芯片检测实验要求。对卵丘细胞样本中RNA逆转录并用Cy3荧光染料进行标记,特异性标记活性为（pmol/ml染料）/（mg/ml c RNA）,A组（4A、5A、7A）分别为21.42、21.70、20.64,B组（4B、5B、7B）分别为21.25、21.47、21.00,符合芯片检测实验要求。两组样本中共检测到lnc RNA 20563个;过滤后数据质量评估,用箱体图分析显示6个样本的lnc RNAs表达水平接近在一个水平。散点图分析结果显示两组卵丘细胞中存在大量差异表达的lnc RNAs。2.两样本间差异表达lnc RNAs的筛选分析,检测到差异表达的lnc RNAs共633个,其中B组vs A组上调表达的lnc RNAs是124个,B组vs A组下调表达的lnc RNAs是509个。对lnc RNA亚组分析:发挥增强子功能的lnc RNAs有925个,增强子附近编码基因的有166个;HOX簇序列的lnc RANs有387个;位于基因间的lnc RNA（Linc RNAs）有2041个,Linc RNAs附近的编码基因有373个。3.部分差异lncRNAs进行实时荧光定量PCR验证,结果与芯片表达结果一致。根据芯片数据,筛选比较了差异m RNAs和lnc RNAs,筛选出共同表达的基因分别为:ASNS、CALB2和NEK7,对应的lnc RNAs分别为:ENST00000429197、NR027910和Y00062。三对m RNAs/lnc RNAs在B组vs A组中均是下调表达。【结论】1.发育成不同质量卵裂期胚胎的人MⅡ期卵母细胞周围的卵丘细胞间存在大量差异表达的lncRNAs,提示了卵丘细胞中这些差异表达的lncRNAs可能参与了对早期胚胎发育的调控机制;对lnc RNAs的亚组分析提示有很多不同功能的lnc RNAs参与m RNAs的转录水平的调节、表观遗传的修饰,对基因的表达起着一定的调控作用。2.Lnc RNA-m RNA关联分析,结果提示ASNS、CALB2和NEK7与对应的lnc RNAs ENST00000429197、NR027910和Y00062在优质胚胎来源的卵丘细胞中上调表达,提示该三对m RNAs/lnc RNAs在卵丘细胞调控早期胚胎发育的机制中可能有相关性。