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梨是我国主栽果树之一,果实含有种类丰富的类黄酮类化合物。其中一些如花青苷类化合物是影响梨果实红色着色的关键色素,另一些其他水果不具备的特有类黄酮组分,如异鼠李素糖苷等化合物则具有潜在药用或保健价值的组分。‘红早酥’梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)是本研究所在的课题组于2004年发现的‘早酥’梨的富类黄酮芽变,在2013年通过了省级品种审定。前期研究表明,‘红早酥’梨除了花青苷合成与着色模式与‘早酥’差异较大外,其整个类黄酮代谢,特别是黄酮醇代谢支路也发生了显著的改变。因此,本研究主要以‘红早酥’梨为材料,研究了其果实类黄酮代谢的调控网络,鉴定出对突变性状有贡献的关键基因PbGA2ox8。主要研究结果如下:1.筛选出与梨果实类黄酮积累相关,可能参与调控类黄酮合成的4个R2R3型MYB转录因子:PbMYB10,PbMYB10b,PbMYB9和PbMYB3。PbMYB10和PbMYB10b,PbMYB9以及与PbMYB3的表达模式与多数类黄酮合成结构基因的表达模式具有较高的相关性,同时其在‘早酥’与‘红早酥’梨中的差异表达模式也与相关的类黄酮组分积累水平一致。由于PbMYB10功能已知,因此本研究下一步重点关注了PbMYB10b,PbMYB9和PbMYB3的功能。进一步的研究表明,PbMYB10b不仅正向调控梨果实中花青苷的合成,同时通过上调结构基因PbDFR的表达影响了原花青素的合成。同时PbMYB9不仅正向调控梨果实原花青素的合成,同时通过上调结构基因PbUFGT1表达影响了花青苷与黄酮醇类物质的合成,且PbMYB9的功能不能被其他基因完全互补,表明PbMYB9是梨类黄酮调控网络中的一个关键转录因子。2.维管束依赖型的花青苷积累与分布造成了‘红早酥’红色条纹果实与红色叶脉叶片,这是‘红早酥’区别于其他常见红色梨品种的重要突变性状本研究系统对比观察了‘红早酥’与‘早酥’花、叶和果等不同组织的着色模式。归纳总结出‘红早酥’区别于其他常见红色梨品种的特殊着色规律:除红色条纹状的果实外,‘红早酥’的其他器官如花器官,叶片以及幼芽等也同样具备红色外观,这些不同器官的红色着色模式具备一个共同点,即红色着色区域不均匀且与维管束的分布相一致;‘红早酥’果实着色模式的另一个特点在于其果点周围同样是红色富集的区域。3.通过对‘早酥’与‘红早酥’幼叶,成熟叶和幼果的差异转录组比较分析,鉴定出26个与红早酥突变性状高度相关的候选基因本研究选择了突变体‘红早酥’中具有维管束依赖型着色模式的三种典型组织(幼叶,成熟叶和幼果)与对应母株‘早酥’的相同器官为材料,通过对比分析其转录本的差异,获得了在表达水平上与该突变性状相关的26个候选基因。在这26个候选基因中,包含了一个依赖于HY5,由PAP(Production of anthocyanin pigment)类MYB转录因子,经由FLS和UFGT催化控制的较为完整的类黄酮合成调控网络,同时也筛选出了HY5下游光响应基因ELIP,矮化相关基因XND1,ABA调控气孔开闭过程相关的转运蛋白ABCG40以及与矮化,环境响应型花青苷积累和植物光形态建成密切相关的赤霉素氧化酶。这些结果首先明确了‘红早酥’中类黄酮合成的大部分调控途径,同时筛选出的其他基因为进一步发掘‘红早酥’其他突变性状提供了方向,最后为定位‘红早酥’一系列突变性状的突变位点,解析‘红早酥’最终的突变机理,在转录层面提供了一个较为清晰的范围。4.鉴定出与突变紧密连锁的相关基因PbGA2ox8,并在‘红早酥’PbGA2ox8启动子部分检测到去甲基化现象我们检测了之前筛选出的26个表达模式与突变相关的候选基因在‘红早酥’红色/绿色杂交后代中的表达,根据表达水平与突变性状(花青苷含量)的相关性,从中筛选出13个与突变性状连锁表达的基因。进一步根据这13个基因在基因组临近的SSR标记,我们发现其中只有相邻PbGA2ox8基因的SSR标记的分离模式与突变性状紧密连锁。本研究进一步利用Genome walking技术克隆了PbGA2ox8的启动子,相较于母株‘早酥’,其启动子区域也发生了明显的去甲基化现象,这符合该基因在红早酥各组织中的超表达现象。5.PbGA2ox8能够在钙离子富集的维管束区域正向调控梨果实和叶片中花青苷的合成,为研究PbGA2ox8是否能够诱导维管束依赖型的花青苷积累,本研究分别在‘早酥’梨幼果和幼叶中,利用瞬时转化技术超表达了PbGA2ox8。转化结果表明,PbGA2ox8能够在这两种组织中诱导花青苷的合成,同时在过表达PbGA2ox8的组织中也检测到花青苷正调控或合成基因PbMYB10,PbUFGT1和PbGSTF12的上调。特别在过表达PbGA2ox8的‘早酥’梨幼叶中,花青苷大量富集在维管束(叶脉)的周围,形成了维管束依赖型的红色着色类型。同时,当‘红早酥’果实中的钙信号被其拮抗剂氯化镧阻遏时,‘红早酥’梨果实不能正常积累花青苷,这表明‘红早酥’果实中花青苷合成积累过程依赖于钙信号。同时在过表达PbGA2ox8的‘早酥’梨幼叶中,当钙信号被氯化镧阻遏时,同样不能形成维管束依赖型的花青苷积累模式。这些结果表明,PbGA2ox8诱导的花青苷积累主要发生在钙元素富集的区域并最终在果实表面形成了和维管束对应的纵向条纹。