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[目的]
1、建立乳胞素诱导PD大鼠模型;
2、探讨雷沙吉兰预处理对乳胞素诱导PD大鼠模型神经元的保护作用,了解雷沙吉兰治疗和预处理的不同效应。
3、探讨雷沙吉兰的保护作用及机制是否与伴侣蛋白介导吞噬作用(CMA)相关。
[方法]
1、分组与给药:采用随机数字表法将SD大鼠随机分为空白对照组、预处理组及治疗组3组,每组12只:预处理组与治疗组SD大鼠进行手术造模。雷沙吉兰给药途径为腹腔注射,每天1次。预处理组SD大鼠造模前7天开始连续给药,治疗组造模后第7天开始连续给药。
2、SD大鼠造模:参照SD大鼠脑立体定位图谱,通过立体定位技术,将乳胞素定向注射入SD大鼠左脑黑质部位。空白对照组注射相应体积DMSO。
3、行为学检测:在造模前1天和造模后第6、13天进行,使用大鼠旋转实验进行评价。
4、大鼠处死与脑组织取材:在造模后10天处死一半大鼠(每组内随机选择),造模后20天处死另一半大鼠。所有大鼠在处死后3分钟内于冰上迅速取出中脑组织,左侧用4％多聚甲醛固定,右侧用灭菌冻存管在超低温冰箱冻存。
5、免疫组织化学法:检测大鼠左侧中脑组织石蜡切片TH、α-syn表达情况,计数阳性细胞。
6、TUNEL:检测大鼠左侧中脑组织石蜡切片细胞凋亡,计算平均细胞凋亡率。
7、半定量RT-PCR:检测大鼠右侧中脑组织Hsc70与LAMP2A表达情况,计算平均灰度值比值。
8、统计方法:实验数据用SPSS13.0 for windows统计软件分析,计量资料用均数±标准差(X±S)表示,P＜0.05为差异有统计学意义。对实验数据中脑组织石蜡切片平均α-syn、TH阳性表达细胞数、平均细胞凋亡率及Hsc70、Lamp2A平均灰度值比值,分别进行各组间多个样本均数比较。计数资料大鼠旋转实验阳性率用非参数检验法(Chi-Square test)检验,P＜0.05为差异有统计学意义。
[结果]
1、行为学检测:模型大鼠在Apo的诱导下,定向右侧旋转,转速大于7rpm,30分钟内超过210r。治疗组模型大鼠旋转实验阳性率(58.3%)显著高于预处理组模型大鼠(16.7%),空白对照组大鼠不发生旋转。
2、免疫组织化学检测:平均TH阳性细胞数预处理组(31～35个)与治疗组(19～32个)模型大鼠较空白对照组(48～62个)显著减少。平均α-syn阳性细胞数预处理组(8～12个)较治疗组模型(4～5个)大鼠减少。平均TH、α-syn阳性细胞数预处理组较治疗组有显著差别,模型大鼠10天组较20天组有差别(P＜0.05)。
3、TUNEL:大鼠左侧中脑组织石蜡切片平均细胞凋亡率,预处理组(0.041～0.060)较治疗组(0.056～0.070)模型大鼠减少(P＜0.05)。模型大鼠10天组与20天组平均细胞凋亡率无显著差别。
4、半定量RT-PCR检测:Lamp2A和Hsc70平均吸光度比值预处理组(5.0～8.3)与治疗组(5.3～8.1)模型大鼠较空白对照组显著升高,模型大鼠10天组和20天组无显著差别。
[结论]
1、乳胞素黑质内定向注射可以引起SD大鼠行为学改变,多巴胺能神经元数量减少,中脑细胞凋亡增多,表明乳胞素黑质内定向注射可以作为建立PD大鼠模型的方法。
2、雷沙吉兰对乳胞素诱导的PD大鼠模型具有神经保护作用,且预处理用药较治疗用药对乳胞素诱导的PD模型大鼠的干预作用更强。
3、雷沙吉兰对乳胞素诱导的PD模型大鼠的干预作用与上调CMA途径关键蛋白Hsc70与Lamp2A相关。